SH-SY5Y 神經細胞中α7神經型尼古丁受體基因過表達對鈣調蛋白表達的影響

張淑麗 呂園園 官志忠 李 毅 齊曉嵐

(貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

SH-SY5Y 神經細胞中α7神經型尼古丁受體基因過表達對鈣調蛋白表達的影響

張淑麗 呂園園 官志忠1李 毅 齊曉嵐

(貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的 構建穩定的α7神經型尼古丁受體(α7 nAChR)過表達的神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y，研究α7 nAChR過表達對鈣調蛋白(CaM)表達水平的影響。方法 設計α7 nAChR引物并擴增α7 nAChR 特異性編碼的核苷酸序列，退火后克隆至pcDNA 3.1 質粒，構建α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質粒。將α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質粒轉染SH-SY5Y細胞，用含G418的培養液篩選，挑選陽性克隆后采用實時熒光定量(Real-time)PCR和蛋白質印跡方法檢測轉染細胞中α7 nAChR mRNA 及蛋白表達水平的變化，蛋白質印跡方法檢測CaM表達水平的變化。結果 構建的α7 nAChR mRNA過表達質粒成功轉入SH-SY5Y細胞后，經G418篩選獲得穩定轉染細胞克隆株，與對照組相比，α7 nAChR mRNA及蛋白表達量分別增加了533%和110%，CaM表達量增加了43%。結論 成功構建了α7 nAChR mRNA過表達的SH-SY5Y細胞株，α7 nAChR表達上調增加了CaM表達水平，這可能與阿爾茨海默病的發病有一定的關系。

α7神經型尼古丁受體；鈣調蛋白；SH-SY5Y 細胞

阿爾茨海默病(AD)以進行性認知功能損傷和記憶障礙為特征的一種中樞神經系統退行性疾病。AD發病早期，膽堿能系統內Aβ沉積的同時伴有α7神經型尼古丁受體(α7 nAChR)的表達減少。此外，AD 早期膽堿能損傷也與α7 nAChR表達以及功能異常有關。α7 nAChR能通過協助第二信使鈣離子，參與調節神經系統的興奮性、神經遞質的釋放、長時程增強(LTP)誘導、改善學習以及記憶能力。在AD患者中，α7 nAChR的激活也會改善患者的注意力、學習及記憶能力。因此，α7 nAChR與AD發病早期有重要的關系。研究表明，促進大腦膽堿能具體信號的調節，增強AD患者的認知能力，最終改善其病癥可能是由于α7 nAChR的激活〔1～3〕。本研究用體外合成的mRNA增強細胞內的α7 nAChR表達，研究其表達增加后鈣調蛋白(CaM)的表達水平，從而探討α7 nAChR對CaM表達水平的影響及其在AD發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗保存的人腦神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞株；HindⅢ、BamH Ⅰ、DEPC購自華美公司；DMEM 高糖培養基、胰酶、雙抗購于HyClone 公司；OPTI-MEM培養基、血清、二甲亞砜(DMSO)購于Gibco公司；由上海生工生物工程技術服務有限公司合成針對 α7 nAChR 的核苷酸模板引物序列；Genopure Plasmid Midi Kit、G418 Solution、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購于 Roche 公司(德國)；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒、瓊脂糖、溴乙啶(EB)、5×TBE、6×上樣緩沖液購于Invitrogen 公司(美國)；兔抗CaM(FL-149)：sc-5537多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體：sc-81178及HRP標記的抗鼠二抗：sc-2005購于 Santa Cruz Biotechnology Inc (美國)；兔抗α7多克隆抗體購于Genetex(美國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的抗兔二抗#7074購于CST(美國)；聚乙烯二氟 (PVDF)膜、ECL-Plus 發光試劑、高效顯影膠片購自 Amersham 公司；Real time PCR 所用試劑均購于Roche公司；普通化學試劑購于 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 α7 nAChR-pcDNA3.1 表達質粒的構建 根據GenBank提供的基因序列，應用Ambion公司網站提供的軟件設計α7 nAChR的引物序列，α7 nAChR上游引物：5′-CCCAAGCTTATGCAGGAGGCAGATATCAGTGGC-3′，下游引物：5′-CGCGGATCCTTACGCAAAGTCTTTGGACACG-3′。以上序列經Blast Search檢測確認了其與α7 nAChR基因以外的人類已知序列無同源性，并由上海生物工程股份有限公司合成，其5′、3′末端分別是 BamHⅠ和 HindⅢ限制性酶切位點。運用逆轉錄PCR的方法獲取人α7 nAChR基因之后電泳鑒定及回收。用T4 DNA 連接酶將其定向克隆至已線性化的質粒pcDNA 3.1之后，構建重組質粒。陰性對照組直接采用pcDNA 3.1空載體。將它們轉化至DH5α大腸桿菌，挑取單克隆擴增培養，抽提去內毒素的細菌質粒DNA，酶切，電泳鑒定插入片段大小，雙向測序鑒定插入的堿基序列核酸及方向。

1.2.2 細胞培養和穩定轉染 用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的高糖DMEM培養基于5% CO2、37℃恒溫中培養SH-SY5Y貼壁細胞。生長良好的細胞用0.25%的胰酶蛋白酶消化接種至六孔板，待其匯合度為80%左右時，在試劑說明書指導下進行GFP熒光質控，摸索最優轉染條件。再分別將不同重組質粒轉入培養良好的SH-SY5Y細胞，設空白對照組、陰性對照組(空載體)、轉染組。于OPTI-MEM培養基中轉染6 h后換10%血清的DMEM培養基，培養24 h之后，加0.8 g/L G418篩選培養基進行篩選，直至出現單克隆細胞。利用有限稀釋法挑取陽性單克隆并進行擴增培養。收集陽性細胞測定α7 nAChR mRNA及蛋白表達水平。實驗重復3次，每次三個復孔。

1.2.3 實行熒光(Real-time)定量PCR檢測α7 nAChR mRNA 表達水平 采用 Trizol一步法提取細胞總 RNA，逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行Real-time PCR。所用試劑為Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)。引物序列參照王凡等〔4〕，α7 nAChR上游引物：5′-ACCACTCACCGTCTACTTCTCC-3′，下游引物：5′-CATCTGGGAAACGAACAGTCTT-3′，擴增片段167 bp；β-actin上游引物：5′-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3′，下游引物：5′-TCATCTTCTCGCGGTTGGC-3′，擴增片段103 bp。采用ABI Step One Plus型實時熒光定量PCR儀(美國)，采集α7 nAChR及β-actin基因擴增各循環的熒光信號，以SDS2.1軟件收集熒光和分析數據。分析結果時以β-actin為內對照，計算α7 nAChR基因在實驗組與對照組的相對水平(RQ=2-△△Ct)。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.4 蛋白表達水平測定 收集細胞，提取細胞蛋白(裂解2 h，14 000 r/min離心5 min)，BCA方法定量，用Western印跡方法檢測α7 nAChR、CaM蛋白表達水平，以β-actin為內對照。用ImageJ軟件分析結果，計算α7 nAChR、CaM蛋白條帶與β-actin蛋白像素灰度的比值作為蛋白表達相對水平。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0 統計軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1 質粒構建的鑒定 將α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳結果在約1 000 bp和5 000 bp處出現兩個條帶，與實驗設計的α7 nAChR基因模板核苷酸長度相符，結果見圖1。將重組質粒進行雙向DNA序列測定得到測序結果與實驗設計的模板核苷酸序列相符(圖2)，進一步表明 α7 nAChR 基因的表達質粒構建成功。

M：DNA Marker (DL5000)；1、2、3、4泳道：α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質粒酶切圖1 α7 nAChR-pcDNA 3.1重組質粒雙酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 α7 nAChR核苷酸序列測序峰圖

2.2 最優化的轉染條件 轉染GFP 24 h之后在488 nm激發光波長下(藍光激發綠光)進行倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光標記率。根據熒光值，轉染試劑∶質粒=3∶1，復合物體積為200 μl(六孔板)，孵育條件為常溫、15 min時轉染最佳，見圖3。

圖3 最優條件的轉染GFP熒光圖(×100)

2.3 轉染α7 nAChR基因后其mRNA 及蛋白表達水平 SH-SY5Y細胞轉染α7 nAChR-pcDNA 3.1質粒后mRNA 及蛋白表達水平〔分別為(533.3±120.2)、(2.161±0.187)〕分別增長533%及110%，與對照組〔分別為(0.999±0.001)、(1±0.102)〕相比差異有統計學意義(P<0.01)；而陰性對照組〔分別為(0.958±0.069)、(1.137±0.152)〕與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。說明已將α7 nAChR轉入SH-SY5Y細胞，且增加了α7 nAChR mRNA和蛋白表達水平。見圖4。

圖4 轉染α7 nAChR-pcDNA 3.1質粒后α7 nAChR蛋白表達水平

2.4 轉染α7 AChR基因后CaM蛋白表達水平 轉染α7 nAChR-pcDNA 3.1質粒后CaM蛋白表達水平(1.445±0.128)增長了43%，CaM蛋白表達水平與對照組(1±0.113)相比差異有統計學意義(P<0.05)。而陰性對照組(0.956±0.142)與對照組相比無差異(P>0.05)。說明上調α7 nAChR水平能增加CaM蛋白表達水平。見圖5。

圖5 轉染α7 nAChR mRNA質粒后CaM蛋白表達水平

3 討 論

膽堿能神經功能缺陷在AD 發病的機制中具有重要作用。nAChR是神經系統中一類非第二信使介導性神經遞質結合的離子通道，由α和β2兩種亞單位構成。它是以不同亞單位組合的五聚體，主要調控細胞內外K+、Na+和Ca2+等離子流動〔2〕，其含量的減少與AD發病相關〔3〕。nAChR廣泛分布于中樞神經系統，α7nAChR是其中較為特殊的亞型，在海馬和皮層神經元中高表達〔5〕，激活的α7nAChR可以調節神經元的興奮性和神經遞質釋放〔6，7〕、改變突觸可塑性〔8〕、幫助神經元抵御內外因素引起的損傷，維持正常的生理功能，且對維持記憶及認知功能十分重要。大量試驗使用了α7 nAChR激動劑治療一些神經退行性疾病與認知障礙如AD，表明加強α7 nAChR功能可能改善AD患者的學習、記憶缺失癥狀〔9，10〕。α7 nAChR受損是膽堿能神經元退化的關鍵因素。最近有研究表明，在老化過程中α7 nAChRs對維持認知功能、學習和記憶能力具有重要性，以及α7 nAChRs對海馬突觸可塑性的重要性〔11〕。研究表明，α7 nAChR對改善AD和精神分裂癥患者的認知障礙有顯著作用〔12，13〕。因此，α7 nAChRs已被確認為一種很有前途的治療藥物〔13〕。本研究將α7 nAChR mRNA片段轉染到SH-SY5Y細胞中，其mRNA和蛋白表達水平明顯增強，表明α7 nAChR mRNA能有效地增強內源性α7 nAChR的表達。

AD發病與神經元內鈣平衡失調有關，這種失調與神經元結構和功能失常甚至細胞死亡有直接的關系〔14〕。配體門控型離子通道的α7 nAChR對Ca2+通透性極強，對維持細胞內鈣穩態具有顯著作用。Ca2+流入神經細胞內與CaM相結合，進一步激活下游涉及維持LTP的級聯反應〔15〕。CaM在細胞中是一種重要的多功能蛋白，40多種通道或酶被它激活，并參與許多生物學功能。CaM不僅與神經元細胞的信號級聯放大系統、突觸可塑性及細胞分化與增生相關，而且在LTP和學習記憶中起著顯著作用〔16，17〕。

本實驗成功構建了α7 nAChR mRNA真核表達載體，有效地增強了 SH-SY5Y 細胞中 α7 nAChR 的表達，為進一步的研究提供了基礎。本實驗結果表明，當α7 nAChR過表達時使CaM蛋白水平表達增加，可能是α7 nAChR增加使Ca2+內流，引起CaM激活，使其成為有活性的鈣-鈣調蛋白復合物(Ca2+/CaM)，其蛋白的表達水平能影響突觸功能可塑性和神經網絡的形成，導致整體認知功能的改變，減緩AD的發病進展及減少AD的發生。因此，α7 nAChR在AD的發病機制中具有重要作用，并為臨床開發治療AD的藥物提供了理論參考依據。

1 Lykhmus O，Voytenko L，Koval L，etal.α7 nicotinic acetylcholine receptor-specific antibody induces inflammation and amyloid β42 accumulation in the mouse brain to impair memory〔J〕.PLoS One，2015;10(3)：1-18.

2 Taly A，Corringer PJ，Guedin D，etal.Nicotinic receptors：allosteric transitions and therapeutic targets in the nervous system〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2009;8(9)：733-50.

3 Cao Y，Xiao Y，Ravid R，etal.Changed clathrin regulatory proteins in the brains of Alzheimer′s disease patients and animal models〔J〕.J Alzheim Dis，2010;22：329-42.

4 王 凡，任家謀，齊曉嵐，等.SH-SY5Y細胞 7尼古丁受體基因抑制對APP代謝的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志，2012;32(23)：5177-9.

5 Conejero-Goldberg C，Davies P，Ulloa L.Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor：a link between inflammation and neurodegeneration〔J〕.Neurosc Biobehav Rev，2008;32(4)：693-706.

6 Cheng Q，Yakel JL.Presynaptic α7 nicotinic acetylcholine receptors enhance hippocampal mossy fiber glutamatergic transmission via PKA activation〔J〕.J Neurosci，2014;34(1)：124-33.

7 Komal P，Gudavicius G，Nelson C，etal.T-cell receptor activation decreases excitability of cortical interneurons by inhibiting α7 nicotinic receptors〔J〕.J Neurosci，2014;34(1)：22-35.

8 Nordman JC，Philips WS，Kodama N，etal.Axon targeting of the alpha 7 nicotinic receptor in developing hippocampal neurons by Gprinl regulates growth〔J〕.J Neurochem，2014;129 (4)：649-62.

9 Medeiros R，Castello NA，Cheng D，etal.α7 Nicotinic receptor agonist enhances cognition in aged 3xTg-AD mice with robust plaques and tangles〔J〕.Am J Pathol，2014;184(4)：520-9.

10 Callahan PM，Hutchings EJ，Kille NJ，etal.Positive allosteric modulator of alpha 7 nicotinic-acetylcholine receptors，PNU-120596 augments the effects of donepezil on learning and memory in aged rodents and non-human primates〔J〕.Neuropharmacology，2013;67(2)：201-12.

11 Ma L，Turner D，Zhang J，etal.Deficits of synaptic functions in hippocampal slices prepared from aged mice null α7 nicotinic acetylcholine receptors〔J〕.Neurosci Lett，2014;570(1)：97-101.

12 Russo P，Del Bufalo A，Frustaci A，etal.Beyond acetylcholinesterase inhibitors for treating Alzheimer′s disease：α7-nAChR agonists in human clinical trials〔J〕.Curr Pharmaorut Design，2014;20 (38)：6014-21.

13 Beinat C，Reekie T，Banister SD，etal.Structure-activity relationship studies of SEN12333 analogues：determination of the optimal requirements for binding affinities at α7 nAChRs through incorporation of known structural motifs〔J〕.Eur J Med Chem，2015;95(2)：277-301.

14 Wang H，Yu M，Ochani M，etal.Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation〔J〕.Nature，2003;421(3)：384-8.

15 Haass C，Selkoe DJ.Soluble protein oligomers in neurodegeneration less ons from the Alzheimer′s amyloid β peptide〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2007;8(2)：101-12.

16 Shytle RD，Mori T，Townsend K，etal.Cholinergic modulation of microglial activation by alpha 7 nicotinic receptors〔J〕.J Neurochem，2004;89(3)：337-43.

17 Breese CR，Adams C，Logel J，etal.Comparison of the regional expression of nicotinic acetylcholine receptor alpha7 mRNA and〔125I〕-alpha-bungarotoxin binding in human postmortem brain〔J〕.J Comp Neurol，1997;387(3)：385-98.

〔2015-12-09修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of over-expression of α7 neural nicotinic receptor gene on the expression of CaM protein in SH-SY5Y cells

ZHANG Shu-Li, Lü Yuan-Yuan, GUAN Zhi-Zhong,etal.

The Key Laboratory of Molecular Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the influence of over-expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) induced by mRNA transfection on the protein level of calmodulin (CaM)，and understand the neuroprotective mechanism of α7 nAChR and its function in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). Methods The recombinant α7 nAChR mRNA was transfected into SH-SY5Y cells, the stable clones were screened by culture medium with G418, and the levels of α7 nAChR mRNA and protein were monitored by using Real-time PCR and Western blot, respectively. The protein level of the CaM was also determined by Western blot.Results Cell clone strains with stable transfection of α7 nAChR mRNA recombinant plasmid was obtained. Compared with controls, the expressions of α7 nAChR mRNA and protein in such cells were increased by the synergist efficiency with 533% and 110%, respectively. The protein level of CaM was increased by 43%. Conclusions Over-expression of α7 nAChR gene resulted from the recombinant α7 nAChR mRNA can increase the level of CaM, which may affect the signal transduction pathway, which suggests that α7 nAChR may play a significant neuroprotective role in the pathogenesis of AD.

α7 nAChR；CaM；SH-SY5Y cell

國家自然科學基金資助項目(81360178)；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)；貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014〔6008〕)；貴州省科技廳項目(201344，黔科合SY字〔2013〕3020)

齊曉嵐(1976-)，女，醫學博士，教授，博士生導師，主要從事老年性癡呆發病機制研究。

張淑麗(1990-)，女，碩士，主要從事神經分子生物學研究。

R749.01

A

1005-9202(2017)06-1307-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.003

1 貴州醫科大學病理學教研室