鹽酸多奈哌齊對淀粉樣蛋白致癡呆樹鼩的治療作用

角建林 鄭 紅 李進濤 王利梅 吳 超 曾 河 鄭永仁

(昆明醫科大學實驗動物學部，云南 昆明 650500)

鹽酸多奈哌齊對淀粉樣蛋白致癡呆樹鼩的治療作用

角建林 鄭 紅 李進濤 王利梅 吳 超 曾 河 鄭永仁1

(昆明醫科大學實驗動物學部，云南 昆明 650500)

目的 探討鹽酸多奈哌齊對樹鼩側腦室內注射β-淀粉樣蛋白(Aβ)后星形膠質細胞及成熟神經細胞的影響。方法 采用GFAP和NeuN免疫組織化學方法檢測各組樹鼩大腦皮質和海馬CA1、CA3、DG區星形膠質細胞和成熟神經元的表達。結果 模型組樹鼩額葉皮質和海馬區GFAP陽性星形膠質細胞數明顯高于對照組(P<0.01)；治療組海馬(P<0.01)和皮質(P<0.05)GFAP陽性細胞數明顯低于模型組。模型組樹鼩額葉皮質和海馬區NeuN陽性成熟神經元數明顯少于對照組(P<0.01)；治療組樹鼩海馬CA1、CA3區(P<0.05)和額葉皮質(P<0.01)NeuN陽性成熟神經元明顯多于模型組。結論 鹽酸多奈哌齊能抑制Aβ1～40引起的樹鼩星形膠質細胞的活化，減輕Aβ對成熟神經元的損傷。

鹽酸多奈哌齊；β-淀粉樣蛋白；星形膠質細胞；成熟神經元；樹鼩

約1/9的65歲以上老年人有阿爾茨海默病(AD)〔1〕。AD是復雜的異質性疾病，多種因素可能參與致病，如遺傳因素、神經遞質、免疫因素和環境因素等。鹽酸多奈哌齊為膽堿酯酶抑制劑，多年臨床研究證實對AD療效顯著。對其機制的進一步研究，可完善鹽酸多奈哌齊抗AD應用的理論依據，也可為AD治療藥物的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 18月齡雄性成年滇緬樹鼩15只。來自昆明醫科大學實驗動物學部，許可證號SCXK(滇)2013-0002。樹鼩分為3組：對照組、模型組、治療組，每組5只。

1.2 主要試劑及儀器 β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～40購自Sigma公司。將Aβ1～40溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分震蕩5 min，待其充分溶解，配成濃度為2 μg/μl，置于37℃避光孵育4 d，使其聚集，老化。鹽酸多奈哌齊：山東羅欣藥業股份有限公司；兔抗人GFAP多克隆抗體、鼠抗人NeuN單克隆抗體：北京中杉金橋公司，腦立體定位儀由成都儀器廠提供。

1.3 動物模型制備 樹鼩用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)肌肉注射麻醉后，固定于腦立體定位儀，頭頂保持水平。備皮、消毒后，切開頭頂正中皮膚，用3%過氧化氫水溶液擦拭軟組織以充分暴露顱骨。選擇右側為注射部位，依照前期實驗結果，以APO平面〔2〕前2.0 mm(A2.0)、中線右側1.0 mm(R1.0)坐標處為穿刺點，鉆開顱骨，此時會有少量腦脊液留出，用棉球擦拭干凈。用微量注射器取孵育好的Aβ1～40或PBS：垂直進針至硬膜下深約5.0 mm(H5.0)，緩慢推入液體，留針10 min后退針，防止藥物反流顱外。醫用碘伏消毒，縫合皮膚。術后給予5 U青霉素鈉鹽肌注，每天1次。連續3 d。

1.4 藥物干預 對照組側腦室注射PBS，模型組和治療組注射Aβ1～408 μl。術后3 d起，治療組灌胃鹽酸多奈哌齊1.0 mg/kg，對照組、模型組灌胃等容積生理鹽水，連續14 d。

1.5 免疫組織化學顯色 各組動物在藥物干預結束后，經左心室灌注固定，取腦，剝離海馬和額葉皮層，常規石蠟冠狀切片。進行尼氏染色、SP法行GFAP和NeuN免疫組織化學顯色，陰性對照用PBS代替一抗。每只動物海馬結構取5張切片，每張切片隨機選取6個高倍視野觀察(400倍)，Image-J圖像分析系統測出GFAP和NeuN免疫反應陽性細胞數。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析及兩兩比較。

2 結 果

2.1 尼氏染色 見圖1，表1。對照組樹鼩海馬CA1、CA3、DG區神經細胞結構完整，神經細胞排列整齊，無明顯尼氏體破裂現象。模型組海馬神經細胞排列散亂，細胞帶斷裂，存活細胞數明顯減少，大量神經細胞出現尼氏體碎裂，細胞凋亡。治療組樹鼩海馬細胞排列尚整齊，但細胞間隙增寬，細胞帶較薄，少量細胞可見尼氏體碎裂。胞質中央尼氏體消失。模型組神經細胞數明顯低于治療組和對照組(P<0.05)，在CA1和CA3區，治療組神經細胞數與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。在樹鼩額葉皮層，正常神經細胞為多邊形，胞質尼氏體呈斑塊狀。模型組神經細胞體積變小，可見核濃密深染、核固縮、凝聚呈凋亡狀細胞，尼氏體減少，胞質色淡。治療組神經細胞數與對照組差異無統計學意義(P>0.05)；模型組顯著低于對照組和治療組(P<0.05)。

圖1 樹鼩海馬和皮層尼氏染色結果(×400)

組別CA1區CA3區額葉皮層對照組85.42±6.211)80.44±5.0311)102.03±9.161)模型組67.61±8.5754.61±7.4776.11±9.31治療組80.13±7.911)72.28±7.161)94.40±8.911)

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

2.2 GFAP免疫組織化學顯色 GFAP免疫反應陽性為棕黃色，主要在胞質和突起。形態完整的星形膠質細胞，呈星形或蜘蛛狀，有明顯的突起。對照組樹鼩海馬CA1、CA3、DG區僅見少量GFAP 免疫反應陽性細胞，突起較少而短，染色淡。模型組樹鼩海馬GFAP 免疫反應陽性細胞數目多，胞體肥大，突起粗長，染色較深。與對照組比較，模型組GFAP 陽性細胞數多(P<0.01)；治療組海馬區GFAP 陽性細胞數較少，顏色較淡，胞體較小，與模型組比較，治療組海馬區GFAP 陽性細胞明顯減少(P<0.01)。在樹鼩額葉皮層，模型組樹鼩GFAP 免疫反應陽性細胞為對照組的5.23倍(P<0.01)，治療組樹鼩GFAP 免疫反應陽性細胞降低為模型組的49.33%(P<0.05)(表2)。

組別CA1區CA3區DG區額葉皮層對照組1.43±0.521)4.02±0.711)4.80±0.831)4.59±0.491)模型組9.64±1.5111.66±1.1420.25±1.6424.04±2.55治療組6.01±0.961)6.61±0.891)11.61±1.141)11.84±0.961)

2.3 NeuN免疫組織化學顯色 NeuN免疫反應陽性呈棕褐色、棕藍色，在神經細胞核特異性表達。在樹鼩海馬CA1、CA3和DG區，與對照組比較，模型組樹鼩NeuN 免疫反應陽性細胞數明顯減少(P<0.01)。在海馬CA1、CA3區，與模型組比較，治療組樹鼩NeuN 免疫反應陽性細胞數量較多，顏色較深，治療組樹鼩NeuN 免疫反應陽性細胞數明顯增加(P<0.05)。在額葉皮層，模型組樹鼩NeuN免疫反應陽性細胞顯著低于對照組和治療組(P<0.01)。對照組樹鼩NeuN免疫反應陽性細胞為124.2個，模型組為對照組的30.43%；治療組為模型組的2.20倍(P<0.01)，但僅為對照組67.0%(P<0.01)。見表3。

組別CA1區CA3區DG區額葉皮層對照組22.61±1.941)26.44±2.9661)219.63±19.1911)124.20±17.551)模型組9.42±2.076.91±0.89184.42±15.7137.80±5.93治療組15.63±1.571)8.62±1.141)206.03±15.161)83.20±11.381)

3 討 論

GFAP是一種膠質中間絲的主要蛋白質，是星形膠質細胞特有、可靠的標志蛋白〔3〕。GFAP過度表達，被認為是星形膠質細胞病理性增多的一個標志〔4〕。星形膠質細胞表面的清道夫受體和晚期糖基化終產物受體是Aβ的結合受體〔5〕。AD大腦中GFAP水平可提高8～16倍〔6〕。活化的星形膠質細胞能釋放細胞因子、NO、過氧化物等炎性介質損害神經元，因此加速AD的進展〔7〕。本實驗結果與前述文獻報道一致，提示AD樹鼩腦組織星形膠質細胞被Aβ激活，這可能在Aβ所致的AD發生發展過程中起重要作用。NeuN的免疫反應性在神經元分化成熟后即開始出現〔8〕，故常作為神經元成熟的一種重要標志。有文獻報道，神經元受損后將喪失NeuN免疫反應性〔9〕，因此，NeuN在一定程度上能夠反映神經元的數量和功能。大腦海馬結構在學習和記憶等高級神經活動中起著重要作用〔10〕。海馬神經元的數量和狀態將影響神經元突觸的可塑性，從而影響海馬對信息的處理和傳遞，并進一步對大腦的認知、記憶和學習功能產生影響〔11，12〕。因此，海馬區神經元大量丟失是AD 的發病機制之一。AD患者大腦新皮層約40%～78%的神經元丟失，其中以額葉和顳葉受害較嚴重〔13〕。本文結果提示，鹽酸多奈哌齊可緩解海馬區和皮層神經元的損傷，神經元的損傷可能是可逆的。推測鹽酸多奈哌齊通過抑制的星形膠質細胞活化，減少星形膠質細胞釋放的對神經元有毒害作用的細胞因子、NO、過氧化物等炎性介質，進而保護神經元。這一結果為臨床治療AD患者，保護患者腦功能，預防AD發生和發展提供了理論依據。

1 Alzheimer's Association.Alzheimer's disease facts and figures.Alzheimer's & dementia〔J〕.J Alzheimer Assoc，2014；10(2)：e47-92.

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3 Tracey KJ，Cerami A.Tumor necrosis factors，other cyokines and disease〔J〕.Ann Rev Cell Biol，1993；9(2)：317-43.

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5 Schubert D，Soucek T，Blouw B.The induction of HIF-1 reduces astrocyte activation by amyloid beta peptide〔J〕.Eur J Neurosci，2009；29(7)：1323-34.

6 Kishore V，Kuchibhotla A，Carli R，etal.Synchronous hyperactivity and intercellular calcium waves in astrocytes in Alzheimer mice〔J〕.Science，2009；323(5918)：1211-5.

7 Cotm A，Tenner C，Cummings A，etal.Aβ-amyloid converts an acute phase injury response to chronic injury〔J〕.Nurobiol Ageing，1996；17(5)：723-31.

8 Sarnat HB，Nochlin D，Born DE，etal.Neuronal nuclear antigen (NeuN)：a marker of neuronal maturation in the early human fetal nervous system〔J〕.Brain Dev，1998；20(2)：8829.

9 Kiyota T，Ingraham KL，Jacobsen MT，etal.FGF2 gene transfer restores hippocampal functions in mouse models of Alzheimer′s disease and has therapeutic implications for neurocognitive disorders〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2011；108(49)：E1339-48.

10 Zhang XL，Zheng SL，Dong FR，etal.Nimodipine improves regional cerebral blood flow and suppresses inflammatory factors in the hippocampus of rats with vascular dementia〔J〕.J Int Med Res，2012；40(3)：1036-45.

11 Liu R，Lei JX，Luo C，etal.Increased EID1 nuclear translocation impairs synaptic plasticity and memory function associated with pathogenesis of Alzhaeimer′s disesse〔J〕.Neurobiol Dis，2012；45(3)：902-12.

12 van de PolL，Gertz HJ，Scheltens P，etal.Hippocampal atrophy in subcortical vascular dementia〔J〕.Neurodegener Dis，2011；8(6)：465-77.

13 李坤成，楊小平，曹麗珍，等.比較神經影像學〔M〕.第2版.北京：科學技術文獻出版社，2012：525-50.

〔2015-12-01修回〕

(編輯 曹夢園)

Effects of donepezil hydrochloride on amyloid-induced dementia in tree shrews

JIAO Jian-Lin,ZHENG Hong,LI Jin-Tao,etal.

Department of Laboratory Animal,Kunming Medical University,Kunming 650500,Yunnan,China

Objective To explore the effects of donepezil hydrochloride on β-amyloid(Aβ)-induced dementia in tree shrews.Methods Fifteen male tree shrews were divided into control,model and treatment groups.The model group was made with unilateral microinjection of aggregated Aβ1～40into lateral ventricle in tree shrews and the control group was injected with PBS instead.The treatment group was administrated with donepezil hydrochloride (1.0 mg·kg-1·d-1) intragastrically after microinjection of aggregated Aβ1～40into lateral ventricle.The GFAP expression of astrocytes and NeuN expression of neurons in the cerebral cortex and hippocampus of each group were detected by immunohistochemical stainning 15 days later.Results The number of GFAP positive astrocyte in the cerebral cortex and hippocampus of model group were obviously increased compared with control group.The number of GFAP positive astrocyte in the cerebral cortex and hippocampus of treatment group were obviously decreased compared with model group.The number of NeuN positive neurons in the cerebral cortex and hippocampus of model group were obviously decreased compared with control group.The number of NeuN positive neurons in the cerebral cortex and hippocampus of treatment group were obviously increased compared with the model group.Conclusions Donepezil hydrochloride could inhibit astrocytic activation induced by Aβ and alleviate damages of mature neurons by Aβ.

Donepezil hydrochloride; Beta-amyloid protein; Astrocyte;Mature neurons; Tree shrews

國家自然科學基金項目(81460647)；云南省科技基金項目(2012FB155)

鄭 紅(1969-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事神經科學研究。

角建林(1966-)，男，高級實驗師，主要從事醫學實驗動物模型研究。

R74

A

1005-9202(2017)06-1323-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.008

1 云南中醫學院實驗動物中心