人骨誘導因子和綠色熒光蛋白基因共表達慢病毒載體的構建和鑒定及在HT-29細胞中的表達

霍永旭 李 宇 劉雁軍 郭元彪 楊春蕾 趙 聰

(四川大學生命科學院，四川 成都 600031)

人骨誘導因子和綠色熒光蛋白基因共表達慢病毒載體的構建和鑒定及在HT-29細胞中的表達

霍永旭 李 宇1劉雁軍2郭元彪3楊春蕾 趙 聰1

(四川大學生命科學院，四川 成都 600031)

目的 構建和鑒定人骨誘導因子基因(hOGN)和綠色熒光蛋白(GFP)共表達慢病毒載體，并檢測其在人大腸癌細胞株HT-29中的表達水平。方法 采用PCR方法克隆hOGN基因；將hOGN基因連接到帶有GFP的慢病毒表達載體pEZ-Lv201中構建慢病毒載體；將構建的慢病毒載體質粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)與慢病毒包裝質粒混合物Lenti-Pac HIV mix共轉染293T細胞，收集慢病毒懸液；重組病毒轉染H1299細胞，定量PCR法檢測重組病毒滴度；將構建的pEZ-hOGN感染HT-29細胞，熒光顯微鏡觀察和Western印跡檢測感染后HT-29細胞中GFP表達情況和目的基因hOGN的表達情況。結果 基因測序分析證實克隆的hOGN基因與GenBank提供的序列完全一致；構建的重組慢病毒載體經雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實OGN正確插入pEZ-Lv201；定量PCR測定慢病毒滴度為0.1×109～1×109TU/ml。在HT-29細胞中重組病毒感染96 h后在熒光顯微鏡下可檢測到較強的綠色熒光蛋白表達，Western印跡檢測到在HT-29細胞中hOGN蛋白過表達。結論 成功構建攜帶hOGN基因的重組慢病毒載體，在HT-29細胞中有效表達。

骨誘導因子；綠色熒光蛋白；慢病毒載體；HT-29細胞

人骨誘導因子(hOGN)基因是富亮氨酸低分子蛋白聚糖家族的成員，存在于結締組織的細胞外基質，具有多種生物學功能，如參與胞外基質的合成，膠原纖維形成的調控等〔1〕。哺乳動物中OGN參與了動脈損傷的修復與重構，因此OGN表達的增高有助于血管的重建〔2〕。近年研究顯示OGN表達的改變與腫瘤的遷移、黏附、增殖有密切的相關性〔3〕，OGN可以抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的分泌〔4〕，而MMPs能夠降解細胞外基質中的各種蛋白，破壞腫瘤細胞侵襲的組織屏障〔5〕，引發大腸癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤細胞的侵襲惡化〔6〕。本研究將人全長OGN基因克隆到慢病毒質粒pEZ-Lv201上，構建重組慢病毒表達載體pEZ-hOGN，并感染人大腸癌細胞株HT-29。該慢病毒表達載體的正確構建，為建立hOGN與腫瘤相關的研究，探討hOGN與大腸腫瘤發生發展的病理機制和基因治療等方面奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株和細胞 慢病毒表達質粒pEZ-Lv201(pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro)為本實驗室保存。大腸桿菌DH5α感受態細胞購買于北京全式金生物技術公司。人大腸癌細胞株HT-29、人胚腎細胞株293T和非小細胞肺癌細胞株H1299均購買于中科院上海細胞庫。

1.2 主要酶和試劑 慢病毒包裝質粒試劑盒(復能基因)；Taq酶、RT試劑盒(Takara)；限制性內切酶ApaI、EcoRI、T4 DNA ligase(NEB)；1 000 bp DNA ladder marker(天根公司)；dNTP(Promega)；Plasmid抽提Kit(Qiagen)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；胰酶(上海化學試劑公司)；RPMI1640、DMEM培養基、胎牛血清(Hyclone)；兔抗OGN一抗(Abcam)；兔抗小鼠eGFP一抗、小鼠抗β-actin，小鼠抗GAPDH一抗(proteintech)；羊抗兔IgG二抗、羊抗小鼠IgG二抗(中杉金橋)；引物合成及測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 hOGN基因的克隆 依據Genbank的hOGN基因的編碼區(CDS)設計相應引物，根據載體質粒pEZ-Lv201的要求在引物中引入EcoRI和ApaI酶切位點。正義鏈：GGAATTACAAGGCTGTTAGAGAG；反義鏈：GGGGCCCTATTAATAACTAATGCATG(劃線部分為酶切位點)，hOGN基因提取于人正常大腸組織，PCR擴增，反應條件：預變性94℃、3 min，變性94℃、30 s，退火55℃、30 s，延伸72℃、1 min，30個循環，72℃延伸5 min。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與Genbank提供的條帶大小897 bp相符，膠回收產物保存待用。

1.3.2 重組慢病毒載體的構建、鑒定和純化 構建和鑒定：慢病毒質粒pEZ-Lv201和目的片段分別經EcoRI和ApaI雙酶切消化，用T4 DNA連接酶連接，形成含GFP基因的克隆重組體。將連接產物轉化感受態細胞DH5α，擴增培養后用EcoRI和ApaI雙酶切鑒定，并測序鑒定插入DNA片段的正確性。

1.3.3 重組慢病毒的包裝和滴度測定 ①包裝：重組慢病毒表達載體質粒pEZ-hOGN、慢病毒包裝質粒復合體Lenti-Pac HIV mix與轉染試劑DNA-EndoFectin complex混合后轉染293T細胞。48 h后收集病毒上清，4℃下500 r/min離心10 min棄去細胞碎片，上清液用0.45 μm聚醚砜低蛋白質鏈接過濾器過濾收集病毒顆粒，濃縮后分裝10 μl/EP管，-70℃保存。②滴度測定：24孔板接種H1299細胞2×105/孔，37℃、5%CO2孵箱中培養至細胞50%融合。慢病毒液分別以0.5、1、2、10、30 μl感染H1299細胞，72 h后熒光顯微鏡下計數GFP陽性細胞數以計算病毒滴度。為避免誤差，只選擇GFP陽性細胞率為1%～30%孔進行計算，取各組平均值計算滴度。

1.3.4 轉染大腸癌細胞株HT-29及其表達情況鑒定 24孔板接種HT-29細胞1×105/孔，24 h后加入預先混好的MOI=10的重組慢病毒完全培養液2 ml，37℃、5%CO2孵箱中孵育12 h后換正常培養基繼續培養，72 h后在熒光顯微鏡觀察細胞轉染情況，并用Western印跡檢測OGN表達情況。

2 結 果

2.1 重組慢病毒載體pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro的構建和鑒定 hOGN基因編碼區DNA片段經PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳中可見897 bp特異性條帶，與理論值一致(圖1A)。hOGN的PCR產物純化后與載體pEZ-lv201進行酶切，連接，轉化后，得到數10個克隆，挑取4個單克隆搖菌，菌落PCR鑒定，結果顯示4個克隆(克隆1，2，3，4)可擴增出897 bp的目的片段(圖1B)。經測序鑒定與Genbank提供的序列一致，未發生任何突變，重組載體pEZ-hOGN構建成功。

A：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測hOGN基因(897 bp有陽性條帶)；B：菌落PCR鑒定克隆載體(1、2、3、4陽性克隆，5陰性克隆，PC陽性對照，NC陰性對照)圖1 hOGN基因與構建的重組慢病毒載體的鑒定

2.2 重組慢病毒包裝與病毒滴度測定 慢病毒包裝試劑盒Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit包裝慢病毒載體pEZ-hOGN及其對照pEZ-eGFP后熒光顯微鏡下觀察(圖2A、2B)。包裝后的慢病毒轉染H1299細胞后(圖2C、2D、2E)，測定慢病毒滴度約為2.12×109拷貝/ml，空載對照慢病毒濃縮后的病毒滴度約為7.9×1010拷貝/ml。

A：重組慢病毒包裝后白光下的293T細胞；B：重組慢病毒包裝后熒光顯微鏡下的293T細胞；C(1、2)：0.1 μl慢病毒載體pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro感染H1299細胞；D(1、2)：1 μl慢病毒載體pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染H1299細胞；E(1、2)：10 μl 慢病毒載體pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染H1299細胞圖2 重組慢病毒包裝與慢病毒滴度檢測

2.3 重組慢病毒感染HT-29細胞 重組慢病毒pEZ-hOGN以MOI為10感染HT-29細胞，感染后72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，感染效率達90%以上(圖3)。

A：明場慢病毒載體轉染后的HT-29細胞B：熒光顯下慢病毒載體轉染后的HT-29細胞圖3 慢病毒pEZ-hOGN感染后的HT-29細胞(×200)

2.4 Western印跡檢測HT-29細胞中hOGN的表達 重組慢病毒感染HT-29細胞，72 h后收集細胞沉淀，提取細胞總蛋白，Western印跡檢測細胞中OGN的表達情況，發現在36 kD左右有一條特異性條帶，其大小和OGN預測條帶相符合，說明包裝產生的高滴度pEZ-hOGN重組慢病毒感染細胞能穩定表達OGN蛋白(圖4)。

OGN：pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染的HT-29細胞；對照組：pEZ-SV40-IRES-Puro感染的HT-29細胞圖4 Western印跡檢測病毒感染HT-29細胞后hOGN的表達

3 討 論

人骨誘導因子是一類較為保守的生物蛋白，含有6 個亮氨酸富集區域，該區域是細胞黏附、信號轉導、DNA 修復和RNA 加工處理的分子識別標志〔7,8〕。OGN蛋白主要分布于心室、角膜、皮膚、小腸、骨等正常組織中，是血管外基質成分之一，可以通過調節左心室肥厚度來應對外在因素的影響〔9〕，調節Ⅰ型膠原纖維的生成，在早期骨細胞中高表達刺激骨細胞的形成〔10〕，以及具在調節細胞生長和分化〔11〕的等方面有重要作用。

最近研究表明hOGN在腫瘤組織和細胞系中異常表達，并且與腫瘤的發生發展有著密切的關系，目前已發現hOGN在肝癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌〔12～14〕等惡性腫瘤中表達異常。大腸癌是世界上常見的高危害消化道惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均位居前列〔15〕。細胞胞外基質環境的變化是大腸腫瘤發生的重要原因之一，而且我們前期研究也發現hOGN在大腸癌細胞中異常表達。因此，構建hOGN在大腸腫瘤細胞系中過表達的模型可以為我們研究大腸腫瘤的發病機制和探索相關分子治療提供了有效的工具。

慢病毒載體是目前一種應用較多的目的基因重組的重要工具，其具有容納外源性目的基因片段大，體內表達穩定，免疫反應小和安全性較好等優點〔16〕。重組的慢病毒載體可以感染非分裂細胞、分裂細胞以及多種組織。此外，pEZ-Lv201慢病毒載體屬于“自殺”性慢病毒，不會利用宿主細胞形成新的病毒顆粒，病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，已成為當前重組基因研究的最佳選擇。

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〔2015-10-02修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省科技廳資助項目(No.14ZC1219)；成都市衛生局資助項目(No.2013089)；成都市科技廳資助項目(No.2014-HM01-00217-SF)

楊春蕾(1964-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事醫學細胞生物學研究。 趙 聰(1962-)，男，教授，碩士生導師，主要從事胃腸道腫瘤研究。

霍永旭(1988-)，男，碩士，主要從事細胞生物學研究。

R34

A

1005-9202(2017)06-1332-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.012

1 成都市第三人民醫院消化內科 2 成都市第三人民醫院普外科

3 成都市第三人民醫院實驗醫學研究部