骨橋蛋白對壓力過負荷心衰小鼠的影響

安 君 王 寧 安 康 高 健 劉旭光

(西北民族大學附屬第一醫院 寧夏人民醫院心胸外科，寧夏 銀川 750021)

骨橋蛋白對壓力過負荷心衰小鼠的影響

安 君 王 寧 安 康1高 健 劉旭光2

(西北民族大學附屬第一醫院 寧夏人民醫院心胸外科，寧夏 銀川 750021)

目的 同步觀察心肌骨橋蛋白(OTN)、血清氨基末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)在過負荷心衰(HF)、過負荷心衰重置于正常負荷小鼠心臟的影響。方法 選用雄性昆明種系小鼠C57BL/6 野生型小鼠，分為Sham組、過負荷HF組、過負荷心衰重新置于正常負荷(HF-NL)組，觀察三組形態學改變、血清NT-proBNP濃度以及OPN mRNA表達。結果 光鏡下Sham組小鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊；過負荷HF組小鼠心肌纖維間隙增寬，心肌細胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細胞呈局灶性壞死；HF-NL組與過負荷HF組比較，心肌纖維間隙增寬得到改善，心肌細胞變性、肥大以及局灶性壞死變輕；血清NT-proBNP濃度在Sham組、過負荷HF組、HF-NL組分別為(54.10±8.91)mg/L、(459.78±22.79)mg/L(與Sham組比較，P<0.01)、(362.67±43.73)mg/L(與過負荷HF組比較，P<0.01)。OPN mRNA表達在正常小鼠中的表達較弱〔(0.95±0.10)%〕；在過負荷HF組增強〔(3.38±0.12)%，與Sham組比較，P<0.01〕，而在HF-NL組表達減輕〔(1.97±0.14)%，與過負荷HF組比較，P<0.01〕。結論 OPN參與過負荷心衰置于正常負荷后的心肌重塑過程，抑制OPN表達可能是減輕、減緩過負荷HF發生、發展的干預靶點之一。

小鼠；過負荷；心衰；骨架蛋白

高血壓等壓力過負荷所致心衰(HF)機制仍不甚清楚，心肌纖維化(MF)是過負荷所致心衰等諸多心血管疾病共同的病理改變〔1〕。MF是指心臟細胞外基質(ECM)中膠原纖維過量積聚,膠原濃度顯著升高或膠原成分發生改變。 ECM作為心肌細胞骨架能感應和傳遞各種刺激信號參與心肌損傷修復和重構，而ECM非結構蛋白一員的骨橋蛋白(OPN)是公認的促纖維化因子〔2〕，通過感應和傳遞各種刺激信號參與心肌損傷修復、重構以及MF。OPN在過負荷HF中的作用不甚清楚。本研究利用小鼠心衰模型，觀察OPN在過負荷心衰以及過負荷心衰重新置于正常負荷(Unloading)狀態下的mRNA表達。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 實驗動物:選用雄性昆明種系小鼠，20～25 g，鼠齡4周齡，共27只，吉林大學動物實驗中心提供。假手術(Sham)組10只；過負荷HF組7只，按文獻方法〔3〕，經胸骨上窩利用鉭夾部分夾閉10 w主動脈弓制備；過負荷HF10重新置于正常負荷3 w(HF-NL)組7只。

1.2 外科手術 按文獻方法〔3〕，制備過負荷HF以及過負荷HF重新置于正常負荷(NL)模型。過負荷HF：小鼠戊巴比妥鈉麻醉，經胸骨上窩顯露主動脈弓，用鉭夾部分夾閉右無名動脈和左頸總動脈間的主動脈弓，縫合皮膚，完成手術。過負荷心衰重新置于正常負荷(HF-NL)模型：過負荷HF 10 w后，經胸骨上窩顯露主動脈弓，取出夾閉的鉭夾，縫合皮膚，完成手術。10 w后在相同麻醉下首先通過心臟超聲動態觀察左室舒張末期直徑以及射血分數(EF)判斷過負荷心衰模型是否合格，不合格小鼠棄之不用。Sham組：手術操作與過負荷HF模型制備組步驟完全相同，僅不用鉭夾夾閉主動脈弓。

1.3 形態學觀察 各組心臟超聲動態觀察完畢將小鼠用過量戊巴比妥鈉處死后用甲醛灌注固定，取左室前壁，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

1.4 檢測指標 取材同時取三組(各6只)小鼠血液,離心、取上清，按照酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒操作說明檢測血清NT-proBNT水平〔4〕。

1.5 OPN mRNA表達 小鼠心肌組織總RNA 提取：按Trizol 法提取說明書提取〔4〕。RNA逆轉錄成cDNA：按RNase H-reverse transcriptase 試劑盒(Invitrogen,USA)說明書步驟進行。實時定量 PCR 檢測：按 SYBR Green Master Mix(Takara,Japan) 說明書試劑盒步驟進行。應用 ABI Prism 7900 數據分析系統(Applied Biosystems，USA)分析，用α-Tubulin為基準校正，進行相對定量分析。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0軟件行單因素ANOVA分析，兩組間用配對t檢驗。

2 結 果

2.1 形態學觀察 光鏡下Sham組小鼠心肌細胞結構完整，肌纖維排列整齊；過負荷HF組小鼠心肌纖維間隙增寬，心肌細胞呈不同程度變性及肥大，部分心肌細胞呈局灶性壞死；HF-NL組與過負荷HF組比較，心肌纖維間隙變窄，心肌細胞變性、肥大以及壞死變輕。見圖1。

Sham組

過負荷HF組

HF-NL組

2.2 血清NT-proBNP濃度測定 血清NT-proBNP濃度在Sham組、過負荷HF組、HF-NL組分別為(54.10 ± 8.91)mg/L、(459.78±22.79)mg/L、(362.67 ± 43.73)mg/L；組間比較差異均有統計學意義P<0.01。

2.3 OPN mRNA表達 OPN mRNA表達在Sham組表達較低(0.95 ± 0.10)%，在過負荷HF組的表達明顯增強〔(3.38 ± 0.12)%〕,與Sham組比較P<0.01〕，而將負荷心衰心臟重新置于正常負荷(HF-NL組)，其表達較過負荷HF組顯著減輕〔(1.97 ± 0.14)%,與過負荷HF組比較，P<0.01〕，見圖2。

圖2 各組OPN mRNA表達

3 討 論

MF 是多種心血管疾病共同的病理改變,與高血壓等壓力負荷引起的心衰、心律失常和心源性猝死密切相關〔1〕。人的OPN基因定位于染色體 4q13 上,為單拷貝基因，不同異構體的表達和功能具有細胞特異性,其具體機制尚不清楚〔5〕。OPN的表達在正常心肌很低,但在纖維化心肌中明顯升高，給予血管緊張素Ⅱ后,小鼠心肌骨橋蛋白表達升高較MF 提早出現〔6〕，OPN的表達在壓力超負荷小鼠左室心肌和轉化生長因子-β誘導的心臟成纖維細胞(CFB)中均顯著升高〔7〕，心肌細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞等均能表達OPN。

本研究結果表明，OPN mRNA表達變化與同步觀察的心肌形態學以及血清NT-proBNP濃度改變相一致，證明OPN參與壓力負荷導致的心衰過程。 有報道亞硝基左旋精氨酸甲酯誘導的高血壓模型大鼠心肌骨橋蛋白表達下降后，其間質纖維化、單核細胞浸潤以及心肌細胞肥大也有所改善〔8〕，也有報道在OPN基因缺失小鼠中的MF程度也明顯減輕〔9〕，這與本研究的OPN在HF中表達增強，而將過負荷HF重新置于正常負荷時表達得到改的結果相一致。多種生物分子,如白細胞介素(IL)-1β、干擾素-γ等能促進CFB表達OPN。我們在也報道，IL-17A直接以及通過基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9調控參與小鼠過負荷心衰過程〔4〕。OPN與IL-17A調控機制可能加速過負荷引起的MF以及心衰的發生、發展過程，提示OPN與IL-17A在過負荷心衰的發生、發展可能具有某種調控關系。本研究提示OPN參與小鼠壓力過負荷引起的心衰發生以及過負荷心衰置于正常負荷后的心肌重塑過程，抑制OPN表達可能是減輕、減緩過負荷心衰發生、發展的干預靶點之一。

1 Weber KT,Díez J.Targeting the cardiac myofibroblast secretome to treat myocardial fibrosis in heart failure〔J〕.Circ Heart Fail,2016;9(8):e003315.

2 Mahipal Singh,Suman Dalal,Krishna Singh.Osteopontin:at the cross-roads of myocyte survival and myocardial function〔J〕.Life Sci,2014;118(1):1-6.

3 安 君,李永財,劉旭光,等.微創小鼠心衰模型的建立〔J〕.中國胸心血管外科臨床雜志,2016;23(11):1099-102.

4 安 君,李永財,劉旭光,等.白介素-17A對壓力過負荷心衰小鼠的影響〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(3):1046-7.

5 Gimba ER,Tilli TM.Human osteopontin splicing isoforms:known roles,potential clinical applications and activated signaling pathways〔J〕.Cancer Lett,2013;331(1):11-7.

6 Cardin S,Scott-Boyer MP,Praktiknjo S,etal.Differences in cell-type-specific responses to angiotensin Ⅱ explain cardiac remodeling differences in C57BL/6 mouse substrains〔J〕.Hypertension,2014;64(5):1040-6.

7 Engebretsen KV,Skardal K,Bjornstad S,etal.Attenuated development of cardiac fibrosis in left ventricular pressure overload by SM16,an orally active inhibitor of ALK5〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2014;26：148-57.

8 Ndisang JF,Chibbar R,Lane N.Heme oxygenase suppresses markers of heart failure and ameliorates cardiomyopathy in L-NAME-induced hypertension〔J〕.Eur J Pharmacol,2014;5：23-34.

9 Schunke KJ,Coyle L,Merrill GF,etal.Acetaminophen attenuates doxorubicin-induced cardiac fibrosis via osteopontin and GATA4 regulation:reduction of oxidant levels〔J〕.J Cell Physiol,2013;228：2006-14.

〔2016-10-15修回〕

(編輯 郭 菁)

安 君(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事心衰機制和防治研究。

R541.3

A

1005-9202(2017)06-1339-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.015

1 上海交通大學附屬新華醫院心胸外科

2 吉林大學第一醫院心臟外科