人真皮間充質干細胞防治中老年增生性瘢痕形成早期成纖維細胞的效果

錢曉鶯 周 宇 趙春華 張玲玲

(浙江省榮軍醫院皮膚科，浙江 嘉興 314000)

人真皮間充質干細胞防治中老年增生性瘢痕形成早期成纖維細胞的效果

錢曉鶯 周 宇 趙春華 張玲玲

(浙江省榮軍醫院皮膚科，浙江 嘉興 314000)

目的 探討人真皮間充質干細胞(hDMSCS)對中老年增生性瘢痕形成早期成纖維細胞的防治機制。方法 中老年增生性瘢痕患者12例，按瘢痕形成時間分為6個月組、1年組、2年組，每組各4例，術中留取瘢痕組織標本，分離瘢痕成纖維細胞。采用非接觸Transwell共培養體系培養hDMSCS和瘢痕成纖維細胞21 d，瘢痕成纖維細胞用普通6孔板培養相同時間為對照，RT-PCR和Western印跡檢測纖維化相關因子α-血管平滑肌肌動蛋白(SMA)、核心蛋白多糖(DCN) mRNA和蛋白表達情況。結果 hDMSCS經誘導成功向成脂、成軟骨、成骨細胞分化，符合間充質干細胞最低鑒定標準。共培養21 d后，6個月組、1年組、2年組瘢痕成纖維細胞α-SMA、DCN mRNA及蛋白表達量與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中以增生性瘢痕形成早期(6個月組)α-SMA、DCN mRNA和蛋白變化最為明顯。結論 hDMSCS可下調瘢痕成纖維細胞α-SMA mRNA和蛋白的表達，上調DCN mRNA和蛋白的表達，且對早期成纖維細胞作用明顯。

間充質干細胞；成纖維細胞；瘢痕

增生性瘢痕是纖維化疾病的一種，可引發不同程度的功能障礙〔1〕，其機制仍未明確，臨床多給予瘢痕組織內注射、壓力療法、硅膠片等治療，但難以獲得理想療效〔2〕。近年研究發現，間充質干細胞(MSCS)具有抗纖維化、調節免疫反應等生物學作用，將其用于增生性瘢痕防治受到該領域廣泛關注〔3〕。本研究將人真皮MSCS(hDMSCS)與不同發展階段的增生性瘢痕成纖維細胞體外共培養，觀察其對纖維化相關因子α-血管平滑肌肌動蛋白(SMA)、核心蛋白多糖(DCN)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取在本院行手術治療的中老年增生性瘢痕患者12例，年齡52～71歲，按瘢痕形成時間分為6個月組、1年組、2年組，每組各4例，術中留取瘢痕組織標本。hDMSCS購于上海中喬新舟生物科技有限公司；低糖DMEM細胞培養液、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)均購于上海冠導生物工程有限公司；鼠抗α-SMA多克隆抗體、兔抗DCN單克隆抗體購于上海信裕生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hDMSCS體外誘導分化 細胞復蘇后用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基培養至融合度達85%～90%時，按1∶2比例傳代，每48 h換液1次。取第2代對數期hDMSCS細胞，消化、離心后按誘導分化培養基說明書制備細胞懸液，按規定細胞濃度接種到6孔板，分別用油紅O染色鑒定向脂肪細胞誘導分化，茜素紅染色鑒定向成骨細胞誘導分化，阿利辛藍染色鑒定向軟骨細胞誘導分化，均以加常規培養液的細胞為對照。

1.2.2 瘢痕成纖維細胞的分離及纖維化相關因子檢測 術中切取的增生性瘢痕組織，洗去血跡，分離表皮組織，暴露真皮層瘢痕組織，剪成邊長1 mm的小塊，消化后用200目濾網過濾，收集濾液，2 000 r/min離心20 min，細胞培養液重懸細胞，按1×106/ml的細胞密度接種到細胞培養皿，常規培養至細胞覆蓋面積>90%后胰酶消化，細胞培養液重懸細胞，即為原代瘢痕成纖維細胞。

1.2.3 hDMSCS與瘢痕成纖維細胞體外共培養 取第3代對數期hDMSCS和瘢痕成纖維細胞離心重懸，分別調整密度為1×105/ml、5×104/ml。用0.4 μm的Transwell共培養板，將hDMSCS與各組瘢痕成纖維細胞行體外非接觸式共培養，上層為3 ml hDMSCS，下層為3 ml瘢痕成纖維細胞；對照組在6孔板中加3ml濃度為1×105/ml的瘢痕成纖維細胞。培養21 d后取下層瘢痕成纖維細胞。

1.2.4 纖維化相關因子檢測 RT-PCR檢測瘢痕成纖維細胞中α-SMA mRNA和DCN mRNA的表達情況：Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，PCR反應體系40 μl，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，常規反應條件下共進行40個循環，以β-actin為內參計數相對表達量。Western印跡檢測α-SMA和DCN蛋白表達情況：取瘢痕成纖維細胞裂解液提取總蛋白，行聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳，轉移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉后加α-SMA、DCN一抗(1∶200)，孵育過夜，加二抗(1∶1 000)，化學增強發光法(ECL)顯色，Quantity One軟件檢測各目標條帶灰度值。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 hDMSCS體外誘導分化情況 向成脂肪細胞分化：加入誘導液后細胞體積變大，胞內出現脂肪滴，細胞形態由長梭形漸變為橢圓形和多角形，隨著時間延長，脂肪滴數量不斷增加，體積增大并聚集，第28天后多數細胞油紅O染色陽性，呈紅色顆粒。向成骨細胞分化：誘導后，胞外基質有少量鈣鹽沉積，隨著時間延長，鈣鹽沉積增多；第21天后細胞結構逐漸喪失，有明顯的骨化結節，茜素紅染色呈陽性，為暗紅色。向成骨細胞分化：加入誘導劑后細胞逐漸由梭形變為多邊形，誘導21 d后阿利辛藍染色為陽性。見圖1。

2.2 hDMSCS共培養前后α-SMA、DCN mRNA表達情況比較 RT-PCR檢測顯示，共培養21 d后，6個月組、1年組、2年組瘢痕成纖維細胞α-SMA、DCN mRNA表達量與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；其中以增生性瘢痕形成早期(6個月組)α-SMA、DCN mRNA變化最明顯。見表1。

圖1 hDMSCS體外多向誘導分化結果(×100)

2.3 hDMSCS共培養前后α-SMA、DCN蛋白表達情況比較 Western印跡檢測顯示，共培養21 d后，6個月組、1年組、2年組瘢痕成纖維細胞α-SMA、DCN 蛋白表達量與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；其中以增生性瘢痕形成早期(6個月組)α-SMA、DCN蛋白變化最為明顯。見圖2。

分組6個月α-SMADCN1年α-SMADCN2年α-SMADCN對照組200.35±16.5762.48±10.82176.35±18.1571.93±12.35126.84±7.0378.42±5.96共培養組51.52±7.531)157.89±15.731)193.27±12.481)155.53±19.241)74.44±7.311)141.93±8.401)

與對照組相比：1)P<0.05

圖2 Western印跡檢測α-SMA、DCN表達

3 討 論

增生性瘢痕是創傷過度愈合反應導致的真皮纖維化疾病。相關研究顯示，成纖維細胞在皮膚修復過程中過度增殖，胞外基質分泌增多，局部炎癥等共同導致了病理性瘢痕的形成〔4〕。α-SMA為細胞骨架蛋白，可經跨膜復合物與纖連蛋白相連，傳遞收縮信號。正常生理狀態下，α-SMA分布于血管平滑肌和肌肉組織中，病理狀態下α-SMA廣泛表達；其在肌成纖維細胞轉化過程中發揮重要作用，而肌成纖維細胞是促進創面愈合的功能細胞，可分泌大量纖黏蛋白、膠原蛋白等生長因子和酶類，當分泌和降解失衡時均可發生病理性瘢痕〔5〕。

胞外基質中蛋白多糖成分異常改變與瘢痕形成密切相關。正常真皮中DCN是含量最多的蛋白多糖，由成纖維細胞合成。DCN是一種富含亮氨酸的胞外基質成分，具有多種生物學功能。研究發現，DCN與轉化生長因子(TGF)-β結合后可抑制其活性，進而抑制細胞基質蛋白沉淀和細胞增殖〔6〕；而真皮細胞層DCN水平降低會引發增生性瘢痕〔7〕；同時，在人肺成纖維細胞中DCN高表達會抑制α-SMA活性，起到抗纖維化作用〔8〕。

近年來研究發現，MSCS可有效拮抗組織纖維化和調節機體免疫反應，其可通過降低膠原沉積，降解胞外基質，逆轉肝纖維化〔9〕。真皮缺損會降低創面愈合中真皮來源的MSCS，但真皮來源的MSCS水平降低是否為誘發病理性瘢痕形成的原因值得進一步探討。本次研究顯示，hDMSCS與不同時期的瘢痕成纖維細胞共培養后，可顯著上調瘢痕成纖維細胞中DCN mRNA和蛋白表達水平，下調α-SMA mRNA和蛋白表達水平，特別是對早期增生性瘢痕的成纖維細胞作用最明顯。提示hDMSCS能夠通過誘導分化和旁分泌基質影響瘢痕成纖維細胞相關因子表達，拮抗增生性瘢痕組織形成。因此，將hDMSCS應用于增生性瘢痕防治具有較好的應用前景。

1 劉杜鵑，張可佳，丁玉紅，等.病理性瘢痕綜合治療的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(7)：1731-3.

2 Varkey M，Ding J，Tredget EEetal.Differential collagen-glycosaminoglycan matrix remodeling by superficial and deep dermal fibroblasts：potential therapeutic targets for hypertrophic scar.〔J〕.Biomaterials，2011；32(30)：7581-91.

3 劉銀平.創傷后瘢痕形成機制及治療的研究〔D〕.廣州：南方醫科大學，2012.

4 Li N，Chen F，Dikkers FG，etal.Dose-dependent effect of mitomycin C on human vocal fold fibroblasts〔J〕.Head Neck,2014；36(3)：401-10.

5 劉寶珩.Smac調節增生性瘢痕成纖維細胞的凋亡〔D〕.重慶：第三軍醫大學，2013.

6 King SN,Chen F,Jette ME,etal.Vocal fold fibroblasts immunoregulate activated macrophage phenotype〔J〕.Cytokine，2013；61(1)：228-36.

7 付曉杰，孫紅霞.丹參酮ⅡA通過調控PKC/CyclinD1通路抗大鼠心肌成纖維細胞增殖作用研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(5)：616-9.

8 朱 璇.胸腺素β4對人增生性瘢痕成纖維細胞膠原合成和CTGF表達的影響〔D〕.南昌：南昌大學，2013.

9 Liu BH，Chen L，Li SR，etal.Smac/DIABLO regulates the apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts〔J〕.Int J Mol Med，2013；32(3)：615-22.

〔2016-06-14修回〕

(編輯 袁左鳴)

周 宇(1982-)，女，主治醫師，主要從事激光整形手術治療研究。

錢曉鶯 (1974-)，女，副主任醫師，主要從事激光整形手術治療研究。

R3

A

1005-9202(2017)06-1350-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.019