缺氧誘導因子-1α和Survivin蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其與人乳頭狀瘤病毒感染的相關性

周 穎 趙 敏 張 輝 謝永紅 李曉超 尹端端

(秦皇島市第一醫院病理科，河北 秦皇島 066000)

缺氧誘導因子-1α和Survivin蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其與人乳頭狀瘤病毒感染的相關性

周 穎 趙 敏 張 輝 謝永紅1李曉超 尹端端2

(秦皇島市第一醫院病理科，河北 秦皇島 066000)

目的 研究非小細胞肺癌(NSCLC)中缺氧誘導因子(HIF)-1α和Survivin蛋白的相關性并分析HIF-1α和Survivin與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染的相關性。方法 應用免疫組化法檢測60例NSCLC及20例肺良性病變組織中HIF-1α、Survivin蛋白的表達，應用PCR方法選用HPV16、18型特異性引物檢測兩組中HPV DNA的表達。 結果 ①NSCLC中HIF-1α和Survivin的表達陽性率分別為48.3%和38.3%，肺良性病變組均未見陽性表達，差異均有統計學意義(P<0.05)。②NSCLC中HIF-1α的表達率與Survivin呈正相關(r=0.335,P<0.05)。③HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%，肺良性病變組5.0%，二者有顯著差異(P<0.05)。④HPV DNA陽性組與陰性組間HIF-1α的陽性表達率分別為52.0%和45.7%，無統計學差異(P>0.05)。HPV DNA陽性組與陰性組間Survivin的陽性表達率分別為36.0%和40.0%，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 HIF-1α與Survivin在NSCLC的發生發展中具有重要作用；HPV感染可能是NSCLC發生的病因學因素之一；然而NSCLC中HIF-1α、Survivin表達與HPV感染均無協同作用。

非小細胞肺癌；缺氧誘導因子-1α；Survivin蛋白；人乳頭狀瘤病毒

缺氧誘導因子(HIF)-1α在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過度表達。HIF-1α可使Survivin蛋白表達增高，推測HIF-1α可能在介導Survivin的轉錄活化中發揮重要作用。人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種DNA病毒，感染人和動物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，研究檢測出肺癌患者攜帶HPV〔1，2〕，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染與肺癌的關系，目前說法不一。然而在肺癌中HIF-1α、Survivin與HPV感染的關系尚未見報道。本文研究非小細胞肺癌(NSCLC)中HIF-1α和Survivin的相關性，探討HIF-1α和Survivin在NSCLC發生發展中的作用，并分析他們與HPV感染的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本 收集秦皇島市第一醫院2012年1～5月NSCLC新鮮標本60例，男46例，女14例；年齡36～80歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結轉移30例，吸煙者43例。20例肺良性病變組織，包括肺結核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴張1例。標本取材后，部分置-20℃保存，部分40%甲醛固定，石蠟包埋。

1.2 HPV PCR檢測

1.2.1 引物 選用分別用來擴增HPV16、18型的特異性引物2對。引物均由北京奧科生物公司合成。HPV16E6正義鏈5′-CTG CAA GCA ACA GTT ACT GCG ACG-3′;反義鏈5′-CAT ACA TCG ACC GGT CCA CC-3′；長度315 bp；HPV18E7正義鏈5′-GAG CCG AAC CAC AAC GTC AC-3′；反義鏈5′-GGA TGC ACA CCA CGG ACA CA-3′；長度152 bp。

1.2.2 組織DNA的提取 取適量凍存組織，加提取緩沖液制成單細胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復抽提3次，再經100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加TE〔10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0〕緩沖液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3 聚合酶鏈反應(PCR)擴增 PCR反應體系：每25 μl反應體系中包含 10×倍緩沖液 2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去離子水16.5 μl及DNA模板2 μl。擴增條件：94℃預變性5 min，循環特征為94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30個循環，72℃延伸8 min。每次實驗以不加模板為陰性對照，HPV16、18型分別用Siha和Hela細胞株DNA作陽性對照。PCR擴增產物用加有溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結果。

1.3 HIF-1α、Survivin免疫組化檢測 HIF-1α抗體、Survivin抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司，染色步驟嚴格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對照用PBS代替一抗。

HIF-1α陽性表達為細胞核出現棕黃或棕褐色顆粒，Survivin陽性表達為胞質出現棕黃或棕褐色顆粒，顯色結果由兩位病理醫生采用半定量評分系統獨立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，取平均值，用半定量積分法判斷結果：0分陰性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽性強度：1分弱表達(淺黃色)；2分中等強度表達(棕黃色)；3分強表達(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強陽性()。就其結果進行分析，將-、±合并為“-”，+、合并為“+”，以簡化數據處理。

1.4 統計學方法 應用SPSS12.0軟件進行統計學分析，組間比較采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 HIF-1α、Survivin的檢測結果及兩者的相關性 NSCLC中HIF-1α的陽性表達位于細胞核(圖1)，陽性率為48.3%(29/60)，肺良性病變組未見陽性表達，二者差異有統計學意義(χ2=15.163,P<0.05)。Survivin的陽性表達位于胞質(圖1)，陽性率為38.3%(23/60)，肺良性病變組未見陽性表達，二者差異有統計學意義(χ2=10.760,P<0.05)。HIF-1α陽性組中Survivin的表達率55.2%(16/29)，明顯高于HIF-1α陰性組〔22.6%(7/31)，χ2=6.733，P<0.05〕，經統計學分析，兩者呈正相關(r=0.335,P<0.05)。

2.2 NSCLC中HIF-1α、Survivin表達與臨床病理特征的關系 NSCLC組中HIF-1α表達與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，與組織分化程度及淋巴結轉移相關。NSCLC組中Survivin表達與性別、年齡、吸煙、組織學分型、組織分化程度無關，與淋巴結轉移相關(P<0.05)。見表1。

2.3 HPV DNA的PCR檢測結果及與臨床病理特征的關系 HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%(25/60)，肺良性病變組5.0%(1/20)，二者有顯著差異(χ2=9.193,P<0.05,圖2)；HPV16、18型特異性引物分型檢測，HPV16型12例，檢出率為48.0%(12/25)，18型13例，檢出率為52.0%(13/25)。NSCLC組HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，而與組織分化程度及淋巴結轉移相關(P<0.05)。見表1。

2.4 NSCLC中HIF-1α、Survivin的表達與HPV感染的關系 HPV DNA陽性組與陰性組間HIF-1α的陽性表達率分別為52.0%(13/25)和45.7%(16/35)，二者差異無統計學意義(χ2=0.231，P=0.631)。HPV DNA陽性組與陰性組間Survivin的陽性表達率分別為36.0%(9/25)和40.0%(14/35)，二者差異無統計學意義(χ2=0.099，P=0.753)。

表1 NSCLC中HIF-1α、Survivin陽性表達及HPV感染陽性表達與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

圖1 NSCLC中HIF-1α及Survivin陽性表達(DAB，×400)

M：Marker；1、2：HPV16 陽性、陰性對照；3、4：HPV16；5、6：HPV18 陽性、陰性對照；7、8：HPV18圖2 PCR檢測HPV16、18型DNA擴增結果電泳圖

3 討 論

HIF-1是由α、β亞單位構成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調節。缺氧是實體腫瘤微環境特征之一。在細胞缺氧時，細胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調節眾多的下游基因以維持或促進腫瘤的血管形成和腫瘤的發展，而且可反饋接受腫瘤生長過程中產生的因子或缺氧環境上調表達，如此形成惡性循環促進腫瘤生長、浸潤和轉移〔3〕。本研究提示HIF-1α在NSCLC的發生發展中起重要作用，與組織分化程度、淋巴結轉移有關，與Swinson等〔4〕的結果基本一致。高分化型HIF-1α的表達率低于中、低分化型，推測腫瘤分化程度降低，缺氧程度明顯加重，HIF-1α表達上調，通過與缺氧反應元件作用便利于腫瘤克服缺氧并誘導新生血管形成，浸潤生長。淋巴結轉移組HIF-1α的表達率高于無淋巴結轉移組。有研究報道HIF-1α通過調節其下游基因VEGF誘導腫瘤新生淋巴管形成；同時上調COX-2，促使癌細胞對基質的黏附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌細胞易于轉移，提示HIF-1α是NSCLC發生發展中的關鍵步驟，并參與腫瘤的侵襲和轉移〔5〕。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是迄今發現最強的凋亡抑制因子，在人類多種腫瘤組織中異常表達〔6,7〕。Survivin具有抑制細胞凋亡、調節細胞周期和細胞分裂的雙重功能，表達于細胞周期的G2/M期，定位于細胞有絲分裂的紡錘體上，通過直接或間接抑制Caspase活性而發揮抗凋亡作用。本研究提示Survivin是NSCLC發生發展進程中的重要因子。陳余清等〔8〕對Survivin啟動子5'上游非編碼序列生物信息學分析發現，Survivin核心啟動子位于TSS上游-203～+64 bp處，其中-19～16 bp和-133～136 bp兩處存在潛在的HIF-1α結合位點。Peng等〔9〕在乳腺癌的研究中發現，在乏氧或常氧條件下，表皮生長因子(EGF)誘導表達的HIF-1α蛋白可通過結合Survivin核心啟動子片段(-203～+27 bp)中的潛在HIF-1α位點，上調Survivin表達。另外，有研究發現在胰腺癌，結直腸癌中過表達的HIF-1α上調Survivin表達〔10〕。體外研究采用HIF-1α基因沉默導致Survivin的表達下調，表明兩者存在顯著正相關〔11〕。陳中建〔12〕和張曉燕等〔13〕研究發現HIF-1α對Notch和胰島素樣生長因子受體誘導的Survivin的表達有協調作用，表明HIF-1α在Survivin的表達調控中起著非常重要的作用。本研究提示Survivin可能是HIF-1α的靶基因之一，HIF-1α通過上調Survivin的表達抑制腫瘤細胞凋亡，兩者在NSCLC發生發展中起協同作用。本研究顯示，Survivin的表達與淋巴結轉移有關，說明Survivin的表達預示腫瘤有較高的侵襲性和不良預后。

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關系已經引起人們的重視〔14〕。本研究提示HPV感染可能是NSCLC發生的病因學因素之一。HPV感染與NSCLC患者臨床病理資料的關系目前尚未明確，本研究發現HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關，與組織分化程度、淋巴結轉移相關。高分化型NSCLC HPV DNA的檢出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的細胞退出了細胞周期，細胞不再具有分裂能力，細胞內僅有少量病毒復制所需的復制酶。淋巴結轉移組HPV DNA的檢出率高于無淋巴結轉移組。Lane等〔15〕報道HPV(+)的腫瘤細胞株與HPV(-)的相比血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平普遍升高。Lopez-ocejo等〔16〕認為HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠使VEGF表達增強。VEGF不僅誘導血管生成，還可誘導腫瘤外周形成新的淋巴管，促進癌細胞通過淋巴管轉移到淋巴結。由此推測HPV感染與淋巴結轉移可能存在一定的相關性。

HIF-1α與HPV感染之間的關系國內外研究較少，其可能的聯系有：野生型P53蛋白可通過直接抑制HIF-1α轉錄活性和通過促進mdm2介導的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解兩種形式抑制HIF-1α活性。而Munger〔17〕報道HPV16、18型E6可以降解野生型P53蛋白。本課題組先前研究也發現，HPV DNA陽性組P53基因的突變失活率明顯高于HPV DNA陰性組。推測HPV16、18型E6可能通過降解野生型P53蛋白，誘導P53基因突變，從而促進HIF-1α的積聚〔18〕，但本研究未發現兩者有相關性。Muzio等〔19〕發現在HPV陽性的鱗狀細胞癌中Survivin亦呈高表達，然而本研究未發現NSCLC中Survivin表達與HPV感染有關聯。

綜上所述，HIF-1α與Survivin在NSCLC的發生發展中具有重要協同作用，檢測NSCLC組織中HIF-1α、Survivin的表達，可以為臨床判斷腫瘤的惡性程度及預后提供有效參考，同時為靶向HIF-1α的抗腫瘤治療提供理論依據和實驗基礎。

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〔2015-08-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

秦皇島市科技支撐計劃項目(2012023A135)

趙 敏(1973-)，女，主任醫師，博士，主要從事腫瘤病理研究。

周 穎(1981-)，女，主治醫師，碩士，主要從事腫瘤病理研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)06-1406-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.044

1 秦皇島市第一醫院科教科 2 秦皇島市第一醫院腫瘤科