修復交叉互補基因1基因單核苷酸多態性與彌漫大B淋巴瘤發病風險及亞型的相關性

蘇 蕊 黃 耘 王思力

(廈門大學附屬第一醫院血液科，福建 廈門 361003)

修復交叉互補基因1基因單核苷酸多態性與彌漫大B淋巴瘤發病風險及亞型的相關性

蘇 蕊 黃 耘 王思力

(廈門大學附屬第一醫院血液科，福建 廈門 361003)

目的 探討修復交叉互補基因(ERCC)1單核苷酸多態性與彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)發病風險及亞型的相關性。方法 DLBCL患者108例，根據病理亞型分為活化B細胞型組(ABC組)和生發中心型組(GCB組)各54例。另選取同期該院體檢中心體檢的健康人群54例作為對照組，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法進行ERCC119007 T>C和ERCC18092 C>A位點多態性檢測，分析ERCC1基因單核苷酸多態性與DLBCL發病風險及亞型的相關性。結果 3組ERCC1基因型中19007 T>C的TT和CT+CC分布頻率差異有統計學意義(P<0.05)，而8092 C>A的CC和CA+CC分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)；4個單體型中2種單體型頻率差異有統計學意義：單體型C-C-C降低了個體DLBCL患病的風險(OR=0.589，P=0.039)，單體型T-C-T則提高了個體DLBCL患病的風險(OR=0.915，P=0.025)；TT和CT基因型發生不同亞型DLBCL發病危險明顯高于CC基因型，且高分化和高分期患者的CT+CC基因型分布頻率高于低分化和低分期患者(P<0.05)。結論 ERCC1基因19007 T>C位點多態性與DLBCL發病風險及亞型發生發展密切相關，攜帶該基因2種不同單體型的個體在DLBCL發病風險及亞型患病風險上存在差異。

ERCC1基因；單核苷酸多態性；彌漫大B淋巴瘤；活化B細胞型；生發中心型

彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤亞型，即典型的多基因病。修復交叉互補基因(ERCC)1單核苷酸多態性是人類基因組DNA中特定位置上單個核苷酸變異引起的DNA多態性〔1〕。多方面的研究顯示ERCC1基因單核苷酸多態性與神經膠質瘤、鼻咽癌、頭頸部鱗癌等腫瘤的發病有關〔2〕。也有研究認為低表達ERCC1基因的患者對含有鉑類的化療方案較為敏感，其預后優于高表達ERCC1基因患者〔3〕。DLBCL主要分為生發中心型(GCB型)、活化B細胞型(ABC型)及縱隔大B型等亞型〔4〕。目前國內外關于ERCC1基因單核苷酸多態性與DLBCL 的相關性研究報道極少。本研究旨在探討ERCC1基因單核苷酸多態性與DLBCL發病風險及亞型的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年5月至2015年5月我院血液科收治的DLBCL患者108例，診斷標準參照2008年第4版《造血和淋巴組織腫瘤》WHO分類〔5〕，并經組織病理學檢查確診。所有患者臨床治療采用以CHOP(環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松)為主的方案化療6～8個療程。根據病理亞型分為ABC組和GCB組各54例，另選取同期我院體檢中心體檢的健康人群54例作為對照組。ABC組男29例，女25例，年齡(52.3±10.5)歲，淋巴瘤國際預后指數(IPI)評分(3.2±0.5)分，Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期8例，Ⅳ期7例；GCB組男28例，女26例，年齡(53.2±11.5)歲，IPI評分(3.6±0.5)分，Ⅰ期19例，Ⅱ期20例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例；對照組男30例，女24例，年齡(51.9±12.5)歲，IPI評分(1.2±0.1)分，3組基本資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 主要試劑：TaqDNA聚合酶試劑、dNTPs、蛋白酶K、電泳瓊脂糖、DNA marker、飽和酚。主要儀器設備：PCR擴增儀、紫外分光光度計、電泳儀、凝膠成像分析系統。

1.2.1 DNA的提取 采集DLBCL患者的外周血及體檢健康者靜脈血各2 ml，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA2K2)抗凝，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作，提取基因組DNA，-70℃保存。

1.2.2 ERCC1基因多態性位點基因型檢測 基于美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫獲得相關基因位點外顯子序列，設計相關外顯子的引物；PCR引物序列：19007 T>C的上游引物為5'-ACGTTGGATGGCACATAGTCGGGAATTACG-3'，下游引物為5'-ACGTTGGATGGGCAATCCCGTACTGAAGTT-3'；8092 C>A的上游引物為5'-ACGTTGGATGCGGATTCTATTGGCTCCGTC-3'，下游引物為5'-ACGTTGGATGGGAGGGCGTCCAGATGCTA-3'。用設計的引物序列對DNA進行PCR擴增，擴增后的序列進行序列測定。對測序獲得的堿基序列與NCBI中的ERCC1基因序列進行比對分析，并結合臨床表型數據，進行單核苷酸基因型判讀。

1.2.3 PCR擴增 10倍緩沖液2 μl，MgCl22.1 μl，dNTP 0.4 μl，上下游引物均為0.4 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，DNA模板2 μl，雙蒸水補足至20 μl。PCR反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性45 s、52℃退火45 s、72℃延伸1 min，32個循環，72℃延伸10 min，進行PCR擴增，采用1.5%瓊脂糖電泳檢測擴增產物。PCR產物用限制性內切酶37℃水浴16 h消化后，酶切產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，即得到ERCC1基因單核苷酸多態性的基因分型。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0 軟件進行χ2檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1 3組ERCC1基因型分布頻率比較 3組ERCC1基因型中19007 T>C的TT和CT+CC分布頻率差異有統計學意義(P<0.05)，而8092 C>A的CC和CA+CC分布頻率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 ERCC1基因SNPs間配對單體型頻率比較 4個單體型中2種單體型頻率有統計學意義：單體型C-C-C(ABC組32.2%，GCB組31.8%，對照組27.6%)，降低了個體DLBCL患病的風險(OR=0.589，95%CI：0.987～1.574，P=0.039)；單體型T-C-T(ABC組33.3%，GCB組31.5%，對照組40.7%)，提高個體DLBCL患病的風險(OR=0.915，95%CI：0.845～1.254，P=0.025)。單體型C-A-T ABC組頻率56.5%，GCB組55.6%，對照組65.7%，P=1.022，OR=0.265，95%CI：0.598～1.254；C-C-T ABC組43.4%，GCB組41.5%，對照組54.3%，P=0.895，OR=0.248，95%CI：0.689～1.986。

2.3 不同亞型DLBCL發病風險與ERCC1基因型分布比較 TT和CT基因型發生不同亞型DLBCL發病危險與CC基因型比較差異有統計學意義(P<0.05)；而且高分化和高分期患者的CT+CC基因型分布率分別高于低分化和低分期患者，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 3組ERCC1基因型分布頻率比較〔n(%),n=54〕

表2 不同亞型DLBCL發病風險與ERCC1基因型分布比較〔n(%),n=54〕

3 討 論

ERCC1基因作為DNA損傷修復的重要基因，第4外顯子的T19007C和3'非編碼區的C8092A是ERCC1基因比較常見的兩種單核苷酸多態。其中，第4外顯子的T19007C可使118號密碼子的編碼序列發生改變，出現單核苷酸 C-T的改變，導致ERCC1基因118的密碼子存在3種等位基因型，即基因型C/C、C/T、T/T。雖然改變后的C/T、T/T基因型編碼序列仍編碼天冬酰胺氨基酸，但ERCC1基因的轉錄水平升高，導致細胞的ERCC1蛋白表達升高，最終引起細胞核苷酸切除修復能力的加強〔6,7〕。ERCC1基因3'非編碼區的C8092A轉變可能通過使ERCC1 mRNA轉錄受到抑制或者使mRNA穩定性降低而導致細胞的DNA核苷酸切除修復能力降低。有研究〔8〕發現亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)677CT和TT基因型能夠降低DLBCL的易感性，而1298CC基因型能夠增加T細胞淋巴瘤的發病風險。而本研究結果顯示19007 T>C的CT和TT可以增加DLBCL發病風險，而且單體型中的T-C-T增加了DLBCL發病風險，C-C-C降低了DLBCL發病風險，而且ABC亞型和GCB亞型的DLBCL均可以增加其發病危險。以往的研究〔9～11〕對DLBCL的MTHFR基因的單核苷酸位點的研究顯示CT和TT基因型能夠降低DLBCL的易感性，CC增加DLBCL的發病危險；腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素(IL)-10基因的單核苷酸位點的研究顯示TNF和IL-10的GA和AA可以增加DLBCL發病危險；氧化應激基因的單核苷酸位點的GA和AA可以增加DLBCL發病危險；關于預后基因的單核苷酸位點的GG增加了DLBCL的發病危險。這些研究均對DLBCL的易感性和預后基因型的多態性進行分析〔12〕。但是將不同亞型的DLBCL應用于其發病危險的研究及ERCC1基因單核苷酸位點多態性對不同亞型的DLBCL的發病危險沒有詳細的報道，本研究結果顯示除了ERCC1基因單核苷酸多態性的TT+CC對DLBCL發病風險及亞型有關，還與患者的分化及分級程度有關。

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3 Rojas L,Cardona AF,Arrieta O,etal.P1.42(also presented as PD2.04):PEM/CBP/BEV followed by maintenance PEM/BEV in hispanic patients with NSCLC:outcomes according to TS,ERCC1 and VEGF:track:advanced NSCLC〔J〕.J Thorac Oncol,2016;11(10S):S208-S209.

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〔2016-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

2014年廈門市科技計劃科技惠民項目(No.3502Z20144003)

王思力(1975-)，女，博士，副主任醫師，主要從事淋巴瘤基礎與臨床研究。

蘇 蕊(1977-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事血液系統疾病研究。

R733

A

1005-9202(2017)06-1409-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.045