煙草卵細胞特異表達基因的克隆與分析

羅 岸

(長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434023)

煙草卵細胞特異表達基因的克隆與分析

羅 岸

(長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434023)

構建煙草卵細胞和合子的cDNA文庫，通過抑制性差減雜交和鏡像選擇進行卵細胞特異表達基因的篩選。篩選結果得到一個卵細胞特異表達的，與胱天蛋白酶基因類似(CASP-like)的基因NtEE1。生物信息學分析表明，NtEE1蛋白由194個氨基酸組成，含有4個跨膜結構域。NtEE1-GFP融合蛋白的亞細胞定位也顯示，該蛋白可能存在于質膜和核膜上。同時擴增擬南芥actin11基因的啟動子序列驅動核定位GFP的表達，并對煙草進行異位轉基因，結果發現，actin11在煙草卵細胞中具有較強的啟動子活性。這些研究結果可以為通過RNAi和過表達來研究NtEE1基因在煙草卵細胞發育和在精、卵細胞相互作用中可能的功能提供理論基礎。

卵細胞；跨膜結構域；煙草；配子相互作用

被子植物胚胎發育的起點源于合子。合子又稱受精卵，由精、卵細胞相互融合而成。眾所周知，在動物精、卵細胞的融合過程中存在著相互識別機制。而被子植物有著獨特的雙受精作用，來自花粉的兩個精細胞分別與胚囊中的卵細胞和中央細胞融合，形成胚和胚乳，整個受精過程都發生在母體組織中，不易對受精事件進行觀察與分析，因此目前對被子植物精、卵細胞在融合過程中存在的相互作用機制還未明確。

對于這個問題的研究可以采用兩種手段：一是利用擬南芥的受精障礙突變體進行分析，不過不同的突變體研究結果有著相互矛盾之處[1-5]；二是利用分離技術獲得離體的植物精、卵細胞進行生理生化和分子生物學檢測，尋找與配子識別、配子結合等相關的基因和蛋白質。自Cass[6]和胡適宜等[7]分別首創精細胞和卵細胞的分離技術以來，水稻、小麥、玉米、煙草、擬南芥、藍豬耳等許多重要的農作物和模式植物的雌雄配子都已獲得[8-16]。而基于cDNA文庫構建技術、基因芯片技術和基因組深度測序技術的發展，目前已經在小麥[8-9]、煙草[10-11]、擬南芥[12]、水稻[13-16]的精、卵細胞中檢測到多種多樣的基因，這為篩選配子相互作用相關基因提供了廣泛的資源和可行的技術路線。

為探索植物配子融合的互作機制，特別是對精、卵細胞在融合過程中相關基因和蛋白的篩選，本實驗室利用分離的煙草卵細胞和合子分別構建其cDNA文庫，通過抑制性差減雜交和鏡像選擇進行卵細胞特異表達基因的篩選，獲得一個卵細胞特異表達、具有跨膜結構的基因NtEE1，以期為進一步利用基因敲除和過表達技術來研究其在精、卵融合和卵細胞發育中可能的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

在pCOMBIA1302載體的骨架上進行改造，從而獲得GFP融合蛋白表達載體，在pART27載體的骨架上進行改造，從而獲得GFP核定位表達載體。大腸埃希菌DH5α感受態購自全式金生物技術有限公司。

1.1.2 植物材料

本試驗所用植物材料為紅花煙草品種SR1(Nicotianatabacumvar. SR1)。供試材料種植于武漢大學生命科學學院所屬溫室，室溫25 ℃，光照16 h·d-1。

1.1.3 主要試劑

常用分子克隆所需試劑(全式金生物技術有限公司和天根生化科技有限公司)，SMART cDNA library kit 試劑盒(TaKaRa公司)，PCR-Select cDNA Subtraction kit 試劑盒(TaKaRa公司)， SMARTer? Pico PCR cDNA Synthesis Kit 試劑盒(TaKaRa公司)，Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥actin11啟動子的克隆和載體構建

取擬南芥幼葉，使用CTAB法提取DNA，擴增actin11啟動子序列，擴增產物經電泳檢測正確后送樣測序。啟動子的擴增引物為actin11-F1： NNNNGGTACCAGTCAGTCGTACAAAGAAACTC；actin11-F2： NNNN TCTAGATTTCTATATCCTGTCAAAATTG。使用雙酶切將擴增片段接入含有NLS:3×GFP的pCOMBIA1302載體中。

1.2.2 煙草卵細胞和合子的分離

按照文獻中提供的方法，從授粉40 h的胚珠中分離到煙草卵細胞[17]，從授粉96 h的胚珠中分離到煙草合子[18]。細胞分離后被轉移到含有2×lysis/binding buffer的0.2 mL EP管中，旋即放入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 mRNA的提取和cDNA的合成

被用于進行抑制性差減雜交的卵細胞和合子的mRNA通過Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 試劑盒提取。A SMART cDNA synthesis kit試劑盒則用于mRNA的反轉和cDNA的擴增，A SMART cDNA library kit試劑盒用于文庫構建。

1.2.4 抑制性差減雜交和鏡像選擇

抑制性差減雜交通過PCR-Select cDNA Subtraction kit試劑盒進行，并用于鏡像選擇[19]。 鏡像選擇得到的cDNA被克隆到T載體中，轉化至大腸埃希菌DH5a中以進行差減分析。

1.2.5NtEE1 CDS的克隆和載體構建

以1.2.3節的cDNA為模板，用文庫中篩選到的NtEE1的EST序列做參考設計引物，擴增NtEE1基因CDS序列。擴增產物經電泳檢測正確后送樣測序。引物為CDS-F1: NNNNGAGCTCATGGAAACAGGGAGCAATATGAATG；CDS-F2: NNNNTCTAGAAAGACGCCTGTTCTTATGGAGGTTC。使用雙酶切將擴增片段接入含有GFP和35S啟動子的pART27載體中。

1.2.6 NtEE1-GFP融合蛋白亞細胞定位和actin11啟動子活性的觀察

應用基因槍法將構建好的NtEE1-GFP融合蛋白載體導入洋蔥表皮細胞，培養24 h后使用普通熒光顯微鏡觀察。使用葉盤法將pactin11::NLS::GFP載體轉入煙草中，分離F1代陽性植株的卵細胞進行熒光觀察。

1.2.7 生物信息學分析

Omega軟件可用于分析NtEE1基因EST序列的開放閱讀框。在線分析軟件Protparam、ProtScale和SOPMA可用于分析和預測NtEE1蛋白的氨基酸組成、基本理化性質及其二級結構。PSORT 軟件可用于預測NtEE1蛋白的亞細胞定位。

2 結果與分析

2.1 煙草精卵細胞與合子的分離

不同于動物，被子植物的生殖發育過程深藏在母體組織中，配子識別、配子融合和合子激活等重要的發育事件，需要通過顯微操作將植物的雌雄配子和早期胚胎分離出來進行觀察研究。本實驗室可分離得到活力良好的精、卵細胞與合子(圖1)，這為篩選配子特異表達基因打下良好基礎。觀察煙草卵細胞可以看到其具有較大的液泡，將細胞核擠至一端，因此賦予卵細胞明顯的極性(圖1-B)。而精卵融合形成合子后，大液泡旋即消失，此時細胞核遷移至細胞中間，合子呈圓形，體積相比卵細胞而言明顯變小(圖1-C)。在受精后72～96 h，合子逐漸伸長，形成長型合子，細胞核則遷移至合點端(圖1-D)，隨后合子將進行不等分裂形成二胞原胚，開始胚胎發育過程。

A，精細胞；B，卵細胞；C，合子；D，長型合子。標尺=10 μmA， the sperm cell; B， the egg cell; C， the zygote; D， the elongated zygote. Bar=10 μm圖1 煙草精、卵細胞與合子Fig.1 Gametes and zygote of tobacco

2.2NtEE1基因在卵細胞與合子中的差異表達

利用已經分離的卵細胞和合子分別構建cDNA文庫，然后利用抑制性差減雜交和鏡像選擇進行卵細胞和合子特異表達基因的篩選。結果表明，NtEE1基因只存在于卵細胞cDNA文庫中。隨后分離新的卵細胞和合子分別構建cDNA池，利用半定量PCR進行檢驗，證實了NtEE1基因的確只在卵細胞中特異表達(圖2)。利用Omega軟件對NtEE1基因的EST序列進行分析，發現NtEE1基因的EST序列中含有一個完整的開放閱讀框，長度582 bp。經過NCBI數據比對發現該基因擁有膜相關的結構域，推測可能編碼一種胱天蛋白酶類似(CASP-like)的蛋白質。

2.3 NtEE1蛋白理化性質分析

使用ExPASy網站的Protparam工具分析NtEE1蛋白的一級結構，發現NtEE1蛋白一級結構由194個氨基酸殘基組成，整個多肽鏈的分子量大小約為20.687 8 ku。軟件預測該蛋白的理論等電點為10.14，因此NtEE1屬于堿性蛋白。分析還發現20種基本氨基酸都存在于該種蛋白中，其中非極性的丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸含量較高，分別為12.4%、16.0%和12.9%。而極性帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)有19個，極性帶負電荷的氨基酸(酸性氨基酸)有7個，脂肪系數為134.18。綜合分析氨基酸序列組成，顯示NtEE1蛋白較不穩定，不穩定系數達到33.64，且蛋白應具有較強疏水性而不是親水性，平均總疏水性為0.857。

A，卵細胞cDNA池；B，合子cDNA池；C，NtEE1基因在卵細胞和合子中的差別表達A， the cDNA pool of egg cells; B， the cDNA pool of zygotes; C， the different expression of NtEE1 in the egg cell and zygote圖2 卵細胞與合子cDNA池及NtEE1基因的表達模式Fig.2 The cDNA pools of the egg cell and zygote and the expression pattern of NtEE1

2.4 NtEE1蛋白二級結構、跨膜結構預測與亞細胞定位分析

生物體內有些蛋白質存在于細胞質膜上，其中一類膜蛋白的多肽鏈可以貫穿質膜的脂雙層結構一次或多次，被稱為跨膜蛋白。其跨膜結構域多數情況下為α-螺旋。使用ExPASy網站的SOPMA工具對NtEE1蛋白的二級結構進行分析，發現NtEE1蛋白的二級結構有4種形式，其中α-螺旋這類二級結構在NtEE1蛋白中含量最高，達到45.36%，所有α-螺旋在整個肽鏈中均勻分布(表1)。而利用ExPAYs網站的TMHMM工具對NtEE1蛋白進行跨膜結構域分析發現，該蛋白具有4個跨膜結構域，由此推斷其很可能是一個跨膜蛋白(圖3)。此外利用ExPASy 網站的PSORT工具和BaCelLo網站對NtEE1蛋白的亞細胞定位進行預測也證實其極可能位于質膜上。

克隆NtEE1基因構建NtEE1-GFP融合蛋白載體，使用35S啟動子驅動其在洋蔥表皮細胞的瞬時表達來驗證NtEE1蛋白的亞細胞定位是否符合預測。由圖4可以看出，作為對照的GFP蛋白在洋蔥表皮細胞的細胞質、細胞質索和細胞核中強烈而均勻地分布，因為有中央大液泡的原因熒光主要集中在細胞周邊。而NtEE1-GFP融合蛋白與GFP蛋白相比，其在細胞核內沒有呈現出強烈均勻的熒光分布，而是在細胞周邊和核膜表面有分布，推測其受跨膜結構域的影響而定位在膜上。

表1 NtEE1蛋白二級結構的預測

2.5 擬南芥actin11基因啟動子在煙草卵細胞中的活性

獲得 pactin11:: NLS::GFP 載體的陽性轉基因植株后分離其F1代陽性植株的卵細胞置于熒光顯微鏡下觀察拍照，結果如圖5所示，擬南芥actin11啟動子驅動的核定位GFP在煙草卵細胞中有較強的表達，可觀察到清晰可辨的綠色熒光。因此該啟動子可用于驅動下游基因在煙草卵細胞中表達，以研究煙草卵細胞特異表達基因的功能。

圖3 NtEE1蛋白跨膜結構的預測Fig.3 Prediction of the transmembrane domains of NtEE1

A、C，洋蔥表皮細胞中NtEE1-GFP熒光分布與明視野；B、D，洋蔥表皮細胞中GFP熒光分布及其明視野。標尺=50 μmA，C： The bright field and the fluorescence of NtEE1-GFP in onion epidermal cells; B， D： The bright field and the fluorescence of GFP in onion epidermal cells. Bar=50 μm圖4 NtEE1-GFP融合蛋白的亞細胞定位Fig.4 Subcellular location of NtEE1-GFP

A、B，actin11基因啟動子驅動的GFP核定位熒光及其明視野。標尺=10 μmA， B： The bright field and the nuclear located GFP fluorescence promoted by actin11 in the egg cell. Bar=10 μm圖5 煙草卵細胞中擬南芥actin11基因啟動子的活性Fig.5 Promotor activity of actin11 in the egg cell of tobacco

3 結論與討論

在煙草卵細胞中特異表達的NtEE1基因含有582 bp的CDS區， NCBI數據庫顯示絨毛狀煙草、美花煙草、土豆和番茄基因組中均發現有類似序列的基因存在。NtEE1作為一種預測的與胱天蛋白酶類似(CASP-like)的蛋白質，可能在卵細胞的發育過程中起著某種獨特的作用。對新獲得的NtEE1蛋白序列進行分析，結果表明，其具有4個跨膜區域，洋蔥表皮細胞中觀察NtEE1-GFP融合蛋白的亞細胞定位，也發現其極有可能定位于細胞的核膜和質膜上。

植物的雙受精過程涉及諸多的信號調控，它們廣泛參與細胞識別、配子激活、質膜粘附與融合以及核融合等過程[20]。到目前為止，人們已經在精細胞膜表面發現了幾個特異的膜蛋白參與配子間相互作用。除了早先在擬南芥中發現的內在蛋白GCS1以外，GEX2 是另一個在精細胞膜表面特異表達的蛋白質，其含有胞外免疫球蛋白樣結構域，GEX2進化相對迅速，對于配子結合相當重要，這與哺乳動物和藻類的配子相互作用因子比較類似[21]。但是在卵細胞中至今只發現一種信號肽EC1，而非膜表面蛋白在配子相互作用中扮演重要角色。擬南芥的5個EC1基因(EC1.1-EC1.5)都編碼信號肽參與激活精細胞，它們在功能上相互冗余。精細胞的內膜系統在接收到卵細胞通過胞吐作用分泌的EC1信號肽的信號后，會將HAP2/GCS1這種潛在的配子促融劑分配到精細胞表面以促進配子融合[22]。因此，植物精子上的膜表面蛋白可能與后生動物和藻類中的一樣參與了配子間的結合和識別[21]。

NtEE1作為一個在卵細胞中發現的特異表達基因，表明在煙草卵細胞中也可能有一種獨特的膜表面蛋白在發揮重要作用。因尚未獲得NtEE1基因自身的啟動子序列，鑒于actin11作為看家基因在植物各個組織中具有廣泛活性，本研究對擬南芥actin11的啟動子序列進行了克隆，用于驅動核定位的GFP表達。結果在轉基因煙草的卵細胞中能觀察到較強的綠色熒光，這說明actin11啟動子序列在煙草卵細胞中具有較強的啟動子活性。這為今后利用actin11啟動子驅動NtEE1相關的RNAi和過表達構建以對NtEE1基因在精、卵相互作用和其在卵細胞發育中可能的功能進行分析打下了基礎，可深化對植物配子發生和配子識別的分子調控機制的認識。

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(責任編輯 張 韻)

Detection and analysis of an egg cell-expressed gene inNicotianatabacum

LUO An

(CollegeofLifeScience，YangtzeUniversity，Jingzhou434023，China)

cDNA pools of the egg cell and zygote of tobacco were constructed， and suppression subtractive hybridization and mirror orientation selection were used to select the genes specially expressed in the egg cell. So a gene namedNtEE1 was found， which was CASP-like gene.NtEE1 encoded 194 amino-acid residues， in which 4 transmembrane domains existed by bioinformatics prediction. The subcellular localization of NtEE1-GFP also indicated that NtEE1 might be located on the nuclear membrane and plasma membrane. The promoter ofactin11 of Arabidopsis was chosen to express nuclear-located GFP. The vector was transformed to tobacco， and the promoter activity ofactin11 was proved to be intensive in the tobacco egg cell. These would provide a foothold to investigate the function ofNtEE1 in the development of egg cell and the mechanism of gamete interaction in tobacco.

egg cell; transmembrane domain; tobacco; gamete interaction

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.02

2016-07-28

長江大學自然科學基金項目(2014NSFY023)

羅岸 (1984—)，男，湖北荊州人，博士，講師，主要從事植物生殖發育研究。E-mail: anluo@whu.edu.cn

S572；Q942.1

A

1004-1524(2017)03-0360-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 360-365

http://www.zjnyxb.cn

羅岸. 煙草卵細胞特異表達基因的克隆與分析[J].浙江農業學報，2017，29(3)： 360-365.