2011—2016年浙江省豬流行性腹瀉病毒S基因與ORF3基因遺傳進化分析

吳旺霞，王一成，吳 潤，袁秀芳，徐麗華，李軍星，蘇 菲

(1.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730000； 2.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

2011—2016年浙江省豬流行性腹瀉病毒S基因與ORF3基因遺傳進化分析

吳旺霞1，2，王一成2，*，吳 潤1，袁秀芳2，徐麗華2，李軍星2，蘇 菲2

(1.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730000； 2.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

為調查近年來浙江省豬流行性腹瀉病毒流行毒株與疫苗株的S基因和ORF3基因遺傳變異情況，2011—2016年，從浙江省各地區采集疑似豬流行性腹瀉病料并提取其RNA，用3對特異性引物對S基因和ORF3基因進行RT-PCR擴增、克隆及測序，并對其序列變化、遺傳進化情況和抗原位點進行分析。結果表明：與國內疫苗株CV777相比，12個樣品株的S基因存在15個核苷酸插入和6個核苷酸缺失，導致氨基酸序列存在5個氨基酸插入(58QGVN61和l40N)和2個氨基酸缺失(163DI164)，且在主要突變區S1區的2個中和表位(499-638和764-771 aa)有8處氨基酸突變；樣品株的ORF3基因有7處氨基酸變異。遺傳進化分析結果顯示，12株分離株的S基因與亞洲主要疫苗株(國內疫苗株CV777和韓國弱毒疫苗株DR13)的同源性僅為93.3%～94.9%，而與2011—2016年中國流行株(BJ-2011和HuN)的同源性高達97.8%～99.9%，表明近年來豬流行性腹瀉病毒呈現較大程度的變異，可為研制更加有效的疫苗奠定基礎。

豬流行性腹瀉病毒；S基因；ORF3基因；序列特點；基因進化分析

豬流行性腹瀉病(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一種急性腸道傳染病，病發主要特征表現為腹瀉、嘔吐、脫水等，且哺乳仔豬具有高發病率和高死亡率。豬流行性腹瀉病于1971年首次在英國發現。中國在20世紀80年代初以來相繼有報道，2010年以來，隨著新毒株的出現，該病在我國的流行情況更趨嚴重[1]。美國自2013年5月PED首次暴發以來，已迅速蔓延至30多個州，波及4 000多個養殖場，累計死亡仔豬超過700萬頭。日本、加拿大、墨西哥等國也相繼暴發此病，歐洲多國也開始研究防止PEDV傳入的策略[2-3]。

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒核酸為正義單鏈RNA，其主要的結構蛋白包括S纖突蛋白(Spike，180～220 ku)、E蛋白(Envelope，8.8 ku)、M膜蛋白(Membrane，27～32 ku)以及N核衣殼蛋白(Nucleocapsid，55～58 ku)，其中，S蛋白是纖突糖蛋白，該蛋白由1 383個氨基酸組成，由4 149個堿基編碼，預測有29個潛在的糖基化位點，這些糖基化位點可能具有重要的生物學意義[4]?；谄渌跔畈《維蛋白保守基因序列，將PEDV S蛋白人為地劃分為S1區(1-789位氨基酸，抗原區)和S2區(790-1383位氨基酸，膜融合區)[5]，S1是變異較大的區域，也是S蛋白的主要功能區域，S2較為保守。S蛋白介導病毒與細胞的吸附和融合，并能誘導宿主產生中和抗體。ORF3是PEDV唯一的輔助基因，位于S和E基因之間，編碼含224個氨基酸的蛋白，該蛋白為一種跨膜蛋白，具有離子通道活性。有研究表明，ORF3與PEDV細胞適應性和毒力有關，ORF3基因的突變可以作為衡量PEDV毒力致弱的重要標志[6]，因此，ORF3是PEDV分子流行病學研究的重要方向。

病原研究的初步結果表明，目前我國從本次流行的腹瀉病豬中檢測到的PEDV大多數為基因2型，與泰國、菲律賓、越南等地2009—2010年所流行的毒株非常相似。序列分析表明，2010年以前PEDV毒株S基因序列與英國標準株CV777同源性很高，達到98%，2010年后，S基因序列與PEDV韓國分離株同源，與CV777的同源性僅有85%左右，存在基因的插入和缺失，PEDVS基因序列的改變可能導致了其流行規律的變化。本實驗通過對浙江省近6年的豬流行性腹瀉病毒S基因和ORF3基因全序列進行比較分析，著重分析其與亞洲主要疫苗株以及近6年中國流行株的序列差異以及抗原位點變化，為更好地監測豬流行性腹瀉并制定有效的防控措施打下基礎。

1 材料與方法

1.1 病料樣品

小腸及內容物采集于浙江省不同地區豬場具有嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和死亡等疑似感染PEDV臨床表現的仔豬。

1.2 酶及化學試劑

MN病毒RNA提取試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、DNA平末端加A試劑盒、T-Vector pMD18、DL 2 000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Pfu DNA polymerse購自生工生物工程(上海)有限公司；大腸埃希菌Trans 10感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計與合成

根據GenBank中發表的PEDVS基因和ORF3基因序列，使用Primer 6.0軟件，設計出3對特異性引物(表1)，其中第3對引物擴增的片段包括ORF3基因。第1對(F1/R1)和第2對(F2/R2)引物擬擴增片段長度為2 000 bp左右，第3對(F3/R3)引物擬擴增長度為1 500 bp左右。

表1 PEDVS基因和ORF3基因擴增引物

Table 1 Amplification primers of PEDVSgene andORF3 gene

引物名稱Primernames序列(5'-3')Sequence(5'-3')位置Position/nt片段長度Fragmentlength/bpF1GAAGAATGGTAAGTTGCTAGTGCGTA20559～227562197R1AGCTAACAACTGTCCAGAATCAGATGF2AAGGGTGAGTTGATTACTGGCACG22503～247412238R2CTAGTAATGACACAACAAAGATGAGAACF3ACCAGATGTAATCCCAGATTACATCG24347～259421595R3GTATCCATAGAATAGCCATCTTGACAC

1.3.2 PEDV的RNA提取

取糞便或腸液，按1∶5用PBS稀釋后研磨，反復凍融3次，8 000g離心10 min取上清，用MN Viral RNA isolation Kit按使用說明書提取病毒RNA，置于-70 ℃保存備用。

1.3.3S基因各片段的擴增和鑒定

按照PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis kit使用說明書，以RNA為模板，Random 6 mers為引物，反轉錄為cDNA。PCR擴增體系(25 μL)：10 × Pfu buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmoL·L-1)2 μL，反轉錄產物(cDNA)2 μL，上下游引物(10 μmoL·L-1)各1μL，Pfu polymerse 0.5 μL，滅菌水16 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 4 min 15 s(第1對和第2對引物擴增)和3 min 30 s(第3對引物擴增)，35個循環；72 ℃ 10 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。

1.3.4S基因各片段的克隆和測序

使用DNA A-Tailing Kit給PCR產物堿基序列平末端加A，將回收純化后的PCR產物連接到pMD-18T載體后，轉化至Trans 10感受態細胞。利用藍白斑篩選，挑取白色菌落進行菌液PCR驗證，每個克隆挑取3個鑒定陽性的菌液委托杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行堿基序列測定。

1.3.5S基因和ORF3基因的測序與比對分析

利用DNAStar軟件中的EditSeq程序拼接所有序列；用MegAlign軟件比較分析樣品毒株與參考毒株(表2)S基因和ORF3基因的核苷酸序列，用DNAStar中的Protean軟件比較分析樣品毒株與參考毒株氨基酸的抗原性。

2 結果與分析

表2 用于序列比對及遺傳進化分析的PEDV參考毒株

Table 2 PEDV strains for sequence comparison and analysis of genetic evolution

序列編號SequenceNo.毒株Strains國家,年份Countriesandyears序列登錄號AccessionNo.1CV777Belgium,1977AF3535112Br1/87Britain,1987Z254833DR13Korea,2006DQ4624044Spk1Korea,2002AF5002155KNU-0801Korea,2008GU1801426Chinju99Korea,1999AY1675857LZCChina,2006EF1859928BJ-2011China,2011JN8257129HuNChina,2011JQ462404

2.1 RT-PCR

以病料樣品提取的RNA為模板，反轉錄得到cDNA，分別用3對引物對PEDV的S基因進行PCR擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳分析，可見到大小分別為2 000和1 500 bp的特異性擴增片段，與預期結果相符(圖1)。

P1、P2、P3分別為第1、2、3對引物擴增PEDV S基因獲得的目的條帶；M，DL 2 000 DNA markerP1、P2 and P3 were the target bands of S gene amplified using 1st， 2nd， 3rd pairs of primers， respectively; M， DL 2 000 DNA marker圖1 PCR擴增S基因各片段電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of different regions of S gene amplified by PCR

2.2 pMD-18T-S陽性克隆的鑒定

如圖2所示，3個片段的重組質粒均擴增出目的條帶，而且目的片段大小正確，測序結果也表明片段大小分別為2 197、2 238和1 595 bp，證明S基因3個片段已成功與pMD-18T載體連接。

2.3 PEDV-S基因的同源性和遺傳變異

將3段測序結果拼接出完整的PEDVS基因序列，根據樣品采集時間與地點將12個樣品株進行命名(表3)。結果表明，2011—2016年浙江省PEDV毒株S基因由4 161個堿基組成，均編碼1 383個氨基酸。

本研究分離的2011—2016年12個樣品株之間S基因的氨基酸序列同源性為97.7%～100%；12個樣品株與Genbank中公布的2011—2016年中國流行株(BJ-2011和HuN)S基因的氨基酸序列同源性高達97.8%～99.9%，而與亞洲主要疫苗株(中國疫苗株CV777和韓國弱毒疫苗株DR13)的氨基酸同源性僅為93.3%～94.9%。

與CV777S基因全長(4 152 bp)相比，12個樣品株的N端存在15個堿基的插入和6個堿基的缺失，分別為164～166位插入TTG，177～185位插入GGGTGTCAA，417～419位插入TAA，480～485位缺失TGGAAA。該插入和缺失導致樣品株S基因的氨基酸序列中存在5個氨基酸的插入(58QGVN61和l40N)、2個氨基酸的缺失(163DI164)(圖3)。

PEDVS基因編碼的蛋白被人工劃分為S1區(第1～789位氨基酸)和S2區(第790～1 383位氨基酸)[7]。目前，在S1區鑒定出3個誘導中和抗體產生的表位，分別為499～638[8]、748～755和764～771 aa[9]。與CV777相比，樣品株的S蛋白氨基酸突變位點大多數位于S1區域，S2區域相對比較保守。樣品株的信號肽區域(1～20 aa)發生了4個氨基酸位點的突變，分別為第2位(R→K)、第5位(I→T)、第10位(L→H)和第15位(P→S)。樣品株的中和抗原表位COE基因在499～638 aa區域發生了8個氨基酸突變，分別是第522位(A→S)、526位(L→H)、528位(S→G)、532位(V→I)、554位(T→S)、599位(G→S)、610位(A→E)、617位(L→F)氨基酸；在748～755 aa區域沒有氨基酸突變；在764～771 aa區域中的第771位氨基酸發生突變(Y→S)。另外，與CV777相比，樣品株在S1區還存在較大變異，分別為第27～29位(QST→PAN)，第55～57位(SMN→IGE)，第68～72位(GTGIE→AGQHP)，第86～87位(DS→RG)，第130～131位(DN→SI)，第159～162位(RDGK→SEHS)，第201～203位(RRS→SGG)，第247～249位(DS→EP)。除此之外，還存在大量的點突變，包括第82位(L→V)、84位(Y→H)、89位(Q→H)、120位(I→T)、138位(V→A)、157位(Y→H)、179位(A→S)、184位(H→Y)、187位(L→F)、197位(R→K)、211位(T→E)、228位(Y→S)、230位(E→Q)、303位(H→Q)、305位(M→I)、347位(L→F)、361位(I→T)、371位(E→V)、459位(S→A)、640位(I→V)、672位(I→F)、712位(N→D)、724位(N→S)、729位(N→S)。

1-6，S1片段(2 197 bp)；7-12，S2片段(2 238 bp)；13-20，S3片段(1 595 bp)；其中3、4、8、9為陰性。M，DL 2 000 DNA Marker1-6， S1 fragment (2 197 bp); 7-12， S2 fragment (2 238 bp); 13-20， S3 fragment (1 595 bp); 3， 4， 8， 9 were negtive. M， DL 2 000 DNA marker圖2 陽性克隆驗證Fig.2 Verification of the positive clones

表3 十二份PEDV陽性病料的來源及名稱

Table 3 The sources and names of 12 PEDV positive strains

毒株名稱Strainnames來源Sources采樣日期Sampledate/(year-month-day)毒株名稱Strainnames來源Sources采樣日期Sampledate/(year-month-day)HN111231海寧Haining2011-12-31FY140714富陽Fuyang2014-07-14HZ111228杭州Hangzhou2011-12-28TZ140310臺州Taizhou2014-03-10HZ120329杭州Hangzhou2012-03-29HZ150314杭州Hangzhou2015-03-14NB120929寧波Ningbo2012-09-29JS151108江山Jiangshan2015-11-08HZ130201湖州Huzhou2013-02-01HZ160916湖州Huzhou2016-09-16ZJ131016諸暨Zhuji2013-10-16JH161023金華Jinhua2016-10-23

圖3 2011—2016年分離毒株與參考毒株S1蛋白(1-789 aa)氨基酸序列比對Fig.3 Analysis of S1 protein (1-789 aa) amino acid sequences of the separated and referenced PEDV strains during 2011 to 2016

2.4 S蛋白的遺傳進化

根據PEDV S蛋白的遺傳變異分析結果，一般將PEDV分為3個群[10](圖4)。本研究中的12個樣品株都屬于第1個群，同屬該群的還有中國其他地區的流行毒株(BJ-2011和HuN)；而年代較早的分離株，包括歐洲毒株(CV777和Brl-87)、韓國毒株(DR13和chinju99)和中國LZC株同屬于第2個群；此外，韓國2002年分離的Spk1株和2008年分離的KNU-0801株同屬于第3個群。

2.5 S蛋白抗原位點變化

12個樣品株可以分為3類，選取具有代表性的2株TZ140310和JH161023，用DNAStar Protean程序，根據抗原指數(antigenic index)對疫苗株CV777、參考毒株KNU-0801、BJ-2011和選取的2個代表毒株S蛋白的抗原表位區進行分析。結果顯示，抗原位點的改變主要集中在S1區。選取變異較大的1～200位氨基酸序列進行抗原表位區比較，如圖5所示，與CV777相比，參考毒株和樣本株S蛋白1～200位氨基酸序列的抗原表位明顯不同(圖5中箭頭所示)，表明流行毒株與疫苗株在抗原性上可能存在差異。

圖4 PEDV S蛋白氨基酸序列的進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of PEDV S protein

2.6ORF3基因氨基酸序列同源性及變異

2011—2016年浙江省PEDV毒株ORF3基因全長675 bp，均編碼225個氨基酸。將分離的12株樣品株的ORF3基因編碼的氨基酸序列與參考毒株進行同源性比對(圖6)。結果表明：12株樣品株ORF3基因彼此之間的氨基酸序列同源性為96.9%～100%，其與疫苗株CV777的同源性為95.6%～96.4%，與中國流行株BJ-2011的同源性為97.8%～99.6%，與韓國毒株chinju99和DR13的同源性為96.9%～99.6%。

箭頭所示為抗原指數不同區域Differences in antigen index were shown as arrows圖5 S蛋白(1～200 aa)抗原指數預測Fig.5 Prediction of antigenic index of S protein(1～200 aa)

利用DNAStar中的MegAlign軟件，對12個樣品株的ORF3基因編碼的氨基酸序列與參考毒株進行了比對分析。結果表明，與氨基酸序列同源性相對比較低的疫苗株CV777相比，分離的12株樣品株ORF3序列存在7處氨基酸變異，包括第21位(V→A)、54位(V→I)、79位(V→I)、92位(L→F)、101位(A→T)、166位(N→S)、182(H→Q)，還存在部分點突變。

圖6 ORF3基因編碼的氨基酸序列變異位點分析Fig.6 Analysis of the mutation sites in the amino acid coded by ORF3 gene

3 討論

PED是近年來危害養豬業最重要的疾病之一，嚴重影響了養豬業的健康發展。自2010年下半年以來，豬流行性腹瀉病在中國出現新一輪的暴發流行。最早發生在廣西，然后湖南、華北、華東、山東、河北等地普遍發病，呈現全國性大流行，造成哺乳仔豬的大量死亡。根據杜曉莉等[11]2010—2013年仔豬腹瀉臨床檢測結果分析，浙江省總體PEDV檢出率為69.30%，并呈現逐年上升趨勢，這說明浙江省仔豬腹瀉的主要病原是PEDV，因此，有必要對PEDV毒株的遺傳變異情況進行調查研究。

PEDV為單股正鏈RNA病毒，由于RNA酶缺乏校正功能，使得RNA病毒很容易發生變異，這可能是導致PED再次爆發的主要原因。鄭逢梅等[12]報道，疫苗免疫或母源抗體并不足以保證豬免受現有PEDV流行毒株的感染，原因可能有2個：一是流行毒株易發生變異，二是流行毒株毒力增強。2011年，劉孝珍等[13]通過分析PEDV的S基因序列，發現了PEDV新變異株。甘振磊等[14]研究表明，PEDV毒株只有1個血清型，目前還沒有跡象表明存在不同的PEDV血清型。但作為RNA的冠狀病毒，在不同的豬群環境、免疫壓力和藥物作用條件下極有可能發生變異。

S基因是PEDV的主要抗原決定基因，其基因結構和功能與病毒的感染性、致病性、抗體的產生和細胞結合能力密切相關。本研究中2011—2016年PEDV樣品株S基因與疫苗株CV777相比，同源性較低，而且存在堿基插入、缺失和突變，而這些插入、缺失和突變最終導致樣品株中出現5個氨基酸的插入(58QGVN61和140N)和2個氨基酸的缺失(163DI164)；與蔡青秀等[15]的研究結果相比，變異位點增加，出現4處氨基酸位點的突變，在中和抗原表位區域，有8處氨基酸位點的突變，在其非功能區域同樣存在大量的變異。S基因的遺傳變異分析結果表明，浙江地區獲得的陽性PEDV毒株屬于同一分支，與2011年中國BJ株和HuN株親緣關系較為密切，但它們均與1999年韓國株Chinju99、2002年韓國株Spk1、2006年中國株LZC及歐洲株(CV777和Brl/87)親緣關系較遠，這與蔡青秀等[15]的分類結果一致。抗原位點變化分析結果表明，流行毒株與疫苗株的抗原性也存在較大差異，這也可能是導致免疫失敗的一個重要原因。

樣品株與近年來中國其他地方流行株的同源性較高，表明S基因無明顯的地域性分布，但是氨基酸的改變導致蛋白質結構和功能的改變，是否會引起流行株感染能力以及流行趨勢的變化，有待進一步研究。樣品株和疫苗株CV777的ORF3基因序列，雖然相對于S基因來說比較保守，但是也存在7處氨基酸變異，并且不同的流行株之間存在差異。流行毒株之間的差異說明變異的多樣性，PEDV流行毒株ORF3的差異對其毒力的影響還有待深入的研究。

綜上，浙江省近6年分離的樣品株與中國近幾年其他地區分離的毒株關系密切，推測中國現流行的PEDV可能具有相同的毒株來源；但是與疫苗株相比，在S和ORF3基因上出現了堿基的缺失、插入和突變，由此導致相關毒力及免疫原性出現差異，這很可能是傳統疫苗保護效力降低的原因。因此，有必要找出不同毒株S基因的抗原位點差異性，研制出更加有效的保護機制。

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(責任編輯 侯春曉)

Genetic analysis ofSandORF3 gene inPorciheepidemicdiarrheavirusduring 2011—2016 in Zhejiang Province

WU Wangxia1，2， WANG Yicheng2，*， WU Run1， YUAN Xiufang2， XU Lihua2， LI Junxing2， SU Fei2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China; 2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

In order to investigate recent genetic variations ofSandORF3 genes inPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV) epidemic and vaccine strains in Zhejiang Province， virus RNA was extracted from suspected PEDV samples which were collected from various areas in Zhejiang Province since 2011 to 2016， then RT-PCR， cloning and sequencing onSandORF3 genes were performed using three pairs of specific primers to analyze the sequence variation， genetic evolution and antigen sites. The results showed that as compared to vaccine strain CV777， 15 nucleotides were inserted and 6 nucleotides were absent in theSgenes of 12 epidemic strains， leading to the insertion of 5 amino acids (58QGVN61and140N) and deletion of 2 amino acids (163DI164) relatively. Moreover， in epidemic strains， totally 8 amino acid mutations were found in two neutralizing epitopes (499-638 and 764-771 aa) on the major mutation region S1; 7 amino acids were variated inORF3 gene. According to the analysis results of genetic evolution， these 12 epidemic strains shared 97.8%-99.9% homology with China epidemic strains BJ-2011 and HuN inSgene， but only 93.3%-94.9% homology with vaccine strains (CV777 and Korean attenuated strain DR13)， indicating that huge variations and fast evolution had emerged in PEDV recently. This study could lay a foundation for development of effective vaccines and therapies.

Porcineepidemicdiarrheavirus;Sgene;ORF3 gene; sequence characteristics; genetic evolution analysis

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.05

2016-08-17

公益技術研究農業項目(2015C32028，2016C32072)

吳旺霞(1991—)，女，甘肅白銀人，碩士研究生，研究方向為獸醫微生物與免疫學。E-mail: 1174478344@qq.com

*通信作者，王一成，E-mail: 95711@sina.com

S858.28

A

1004-1524(2017)03-0380-09

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 380-388

http://www.zjnyxb.cn

吳旺霞， 王一成， 吳潤， 等. 2011—2016年浙江省豬流行性腹瀉病毒S基因與ORF3基因遺傳進化分析[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(3): 380-388.