超聲波處理對多糖理化性質和生物活性的影響

邱軍強，張華，劉迪迪，贠可力，李景彤，王振宇

（哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱150090）

超聲波處理對多糖理化性質和生物活性的影響

邱軍強，張華，劉迪迪，贠可力，李景彤，王振宇*

（哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱150090）

對近年來超聲波降解多糖的研究進展進行綜述，詳細介紹超聲波對多糖物理化學性質、生物活性的影響，主要包括抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗菌活性、免疫調節活性等。并初步分析超聲波的作用機理，為今后超聲波降解多糖的研究發展提供一定的理論依據。

超聲；降解；多糖；物化性質；生物活性

利用超聲聲場降解生物大分子的研究已在環境、化工、食品等領域得到高度關注，多糖作為一類自然界存在最多的高分子量的生物活性物質。研究發現許多天然多糖具有提高免疫[1]、降血糖[2]、抗病毒[3]、抗衰老[4]、抗癌[5]和抑菌[6]等多種生物學活性。然而由于多糖分子量范圍廣，結構極為復雜，且生物利用度低，對于研究其理化性質及生物功能均受到一定的限制。隨著對多糖生物活性的研究，大量文獻報道表明，多糖的高級結構、側鏈的連接位置、分支密度及單糖間糖苷鍵的結合方式均與其生物活性密切相關。此外多糖的聚合度、分子量也影響其生物活性。通過多糖降解進行研究開發多糖逐漸成為國內外研究學者關注的熱點；目前多糖降解方法主要包括物理降解法、化學降解法和生物學方法（如：酶降解法）。近年來國內外大量研究人員爭相報道超聲波對多糖（如：刺槐豆膠[7]、殼聚糖[8-9]、葡聚糖[10]和其他天然多糖等等）理化性質、分子結構和生物活性的影響。如：多糖分子量、多糖黏度、異頭碳構型、單糖組成、分支度以及空間結構等等，與其它方法相比較，超聲降解法成本低廉，同時節省能源和時間，操作程序簡便，無需使用有毒有害試劑，同時基本不產生廢棄物，工業化前景廣闊[11]。

1 超聲波降解多糖的機理

超聲波與聲波一樣，為物質介質中的一種彈性機械波，而根據其工程學特性將其分為檢測超聲和功率超聲，其中檢測超聲為高頻低能型超聲波，其應用的頻率范圍為5×105Hz～5×107Hz之間，能量一般低于1 W/cm2，主要應用于無損檢測和物質物化特性的診斷方面；后者為低頻高能型超聲波，其應用頻率低于100 KHz，而能量高于1 W/cm2，其強大的能量能夠使得介質發生物理裂解，能夠有效的改變物化特性并加速某些化學反應的發生，近年來功率超聲已成為以物理、機械振動、電子材料等學科為基礎的高新技術之一，功率超聲已在機械、冶金、材料、化工、食品、醫藥、紡織及節能環保等許多重要領域得到廣泛的應用[7-9]。超聲波在液體媒介中傳播時能夠產生力學、熱學、光學、電學和化學等一系列物理化學效應，其中包括輻射壓力、直進流作用、空化效應和不穩定的界面等。目前研究認為，超聲波降解多糖的主要機理為機械性斷鍵作用和空化效應。超聲波的機械性斷鍵作用是由于物質的質點在超聲波中具有極高的運動加速度，從而產生激烈而快速變化的機械運動，這種快速變化的機械運動足以引起多糖這類生物大分子主鏈較為敏感的化學鍵斷裂，同時不會引發多糖化學性質完全改變，而使得多糖發生自身降解[12]；此外超聲空化作用產生的高溫高壓條件足以打開結合力強的化學鍵（約377 kJ/mol～418 kJ/mol）[13]。自由基的氧化還原反應主要是由于液體在超聲波作用下，液體內部或者液固交界面上蒸氣或氣體，進入空穴，形成不同大小的氣泡而形成空化效應而導致的。當聲波在媒介中傳播時，若聲強足夠大，液體所受到的負壓也足夠大，媒質分子間的平均距離就會增大，超過極限距離后，破壞液體結構的完整性，造成空穴。這些空穴破碎時會產生局部性的高壓和劇烈的溫度變化，為自由基的產生提供能量。另外溶解樣品溶劑類型不同，其形成的自由基也不相同，所造成的超聲波的反應結果也不相同。自由基和熱效應對低分子量多糖的降解較為有效，而機械效應對高分子多糖的降解效應更為顯著，而且機械效應隨多糖分子量的增加而增加。另外影響超聲空化作用的因素主要包括超聲系統、超聲體系性質（如體系蒸氣壓、溫度、溶劑和溶液中氣體種類等）和超聲波反應器的結構。部分學者認為機械效應所作用的位點靠近最大分子的中心，其中當多糖糖鏈長度超過特定尺寸時，超聲波可能直接通過空穴效應產生的摩擦力使得多糖發生降解[14]。此外超聲波在液體中引起空化效應，能夠產生約4 000 K和100 MPa的瞬間局部高溫和高壓環境，從而使得水分子在這種環境下達到超臨界狀態，進而分解成羥自由基、超氧基等；而羥基自由基作為活性最強的強氧化劑，因此能夠引發局部有機物發生化學鍵斷裂、水相燃燒、高溫分解、超臨界水氧化和自由基氧化等反應，進而發揮其降解效應。

2 超聲波處理對多糖物理化學性質及結構的影響

目前研究表明超聲波對多糖理化性質及結構的影響主要集中于流變學特性、單糖組成比例、摩爾分子量、空間微尺寸和空間構象等[12]。超聲波降解多糖效應主要與超聲功率、超聲處理時間、超聲溫度以及多糖濃度密切相關。

超聲波降解多糖的化學效應主要基于溶液中多糖的羥基和氫自由基，同時與低頻超聲波相比，高頻超聲波具有更劇烈的超聲效應，同時發現超聲波首先會引起多糖空間構象改變以及特性黏度和分子量降低。Li等[15]通過研究不同超聲時間對分子量為1.3 kDa～5×104kDa黃原膠黏度的影響，發現隨著超聲時間的增加，黃原膠的特性黏度在不斷降低，應用ηsp/C=[η]+ k[η]2C數學模型（其中ηsp為增比黏度，ηsp/C為比濃黏度，代表單位濃度下所顯示出的黏度，k為常數，[η]為特性黏度，其反映了高分子與溶劑分子之間的內摩擦。），進行計算得到降解0、5、10、30 min黃原膠的特性黏度分別為16.91、5.65、4.03、3.77 dL/g，而應用ηrel= 1+[η]C數學模型（其中ηrel為相對黏度值。），進而計算得到降解0、5、10、30 min黃原膠的特性黏度分別為38.30、5.97、4.40、2.95 dL/g，結果表明當多糖鏈結構達到一定長度并趨于纏繞時，分子間的相互作用會對超聲降解的效應產生顯著的影響。Zhang等[16]在研究超聲對蘋果果膠結構和流變學性能的影響時，發現超聲的強度和溫度對多糖的降解效應影響最為明顯，蘋果果膠分子量分布隨著超聲時間和強度增加變得更加均一和狹窄，但是超聲降解對蘋果果膠的主鏈組成和單糖組成基本沒有影響，而使得中性糖側鏈尺寸減小，同時紅外光譜分析表明超聲降解使得蘋果果膠甲基化程度降低，此外，與原蘋果果膠相比，超聲降解處理后的蘋果果膠黏度降低了103倍。Zou等[17]通過研究超聲波對7個不同初始分子量葡聚糖的影響時，發現隨著超聲波處理時間的延長，葡聚糖的分子量和分散度在不斷降低，同時葡聚糖的初始分子量越大，溶液濃度越低降解的進程就越快；最后得到的降解葡聚糖溶液更均一，且分子量更低。Zhang等[18]通過比較超聲波降解、超聲波輔助酸降解和酸降解3種降解方法對柑橘果膠的降解作用，發現超聲波降解處理對柑橘果膠的主鏈沒有改變，超聲波處理后的果膠中僅含有線性鏈結構，同時發現經超聲波降解處理后的果膠具有更低的酯化水平，原子力顯微鏡分析表明超聲波降解處理后果膠直鏈長度縮短，分支度降低，由此表明超聲波降解具有節省時間，反應條件溫和及環保等諸多有點。Zhong等[19]通過研究超聲波對裂褶菌多糖的影響時，發現超聲功率為796 W/cm2，超聲時間為30 min，裂褶菌多糖分子量由2.40×103kDa降低至3.89×102kDa。大部分較大分子量片段（106Da～107Da）經過超聲處理后其分子量降低為104Da～105Da；同時超聲波處理使得裂褶菌多糖的分子量分布更為均一。Wang等[20]通過研究超聲波對冬蟲夏草多糖降解作用時，發現給予10 min超聲頻率為20 kHz，超聲功率為35 W/cm2或者更高功率的超聲波處理后，冬蟲夏草多糖的表觀黏度和特性黏度降低了近85%，其水溶性增加了接近4倍；超聲波處理使得冬蟲夏草多糖中最大分子量的多糖分子量顯著降低，同時使得其分子量分布更加均勻，而對多糖分子結構沒有影響；而酸降解僅僅使得其特性黏度降低了20%，表明超聲波降解多糖為一種行之有效的改善大分子量多糖溶解性的方法。王鶴等[21]在研究超聲波對密花石斛多糖理化性質的影響時，發現超聲波功率密度為300 W/cm2和600 W/cm2時能夠顯著降低大分子量密花石斛多糖的相對分子量，而對小分子量密花石斛多糖無明顯影響；同時，超聲處理后密花石斛多糖的特性黏度也呈下降趨勢，并與超聲功率呈正相關；此外超聲波處理能夠使得密花石斛多糖的空間構象發生改變，大紡錘體狀會解聚為尺寸更小、形狀相似、結構緊密的小聚集體及多糖碎片，同時發現大聚集體的解聚程度與超聲功率正相關。

3 超聲波降解法對多糖生物活性的影響

目前多糖在世界范圍內由于其生物活性受到廣泛的關注。大量的動物和臨床研究表明多糖在人體內起著非常重要的作用。越來越多的國內外學者開始利用超聲波降解對多糖生物活性進行改善，進而與天然多糖生物活性進行對比研究。

3.1 超聲波處理對多糖抗氧化活性的影響

自由基的產生是引起機體產生病變的重要原因，當人體內存在過多的自由基會引發一系列的疾病，目前已發現100多種疾病都與自由基過剩有關，試驗研究表明多糖類化合物具有清除自由基、抑制脂質過氧化、抑制亞油酸氧化等抗氧化作用；因此大量研究學者開始關注超聲波降解對多糖抗氧化活性的影響。Guo等[22]在研究不同超聲時間對巖藻聚糖抗氧化活性的影響時，發現超聲降解處理60 min對DPPH自由基清除活性達到最大，而超聲降解處理120 min對氧自由基的清除活性達到最大；而后隨著降解時間增加其抗氧化活性逐漸降低，推測超聲降解處理分為兩個階段：當超聲處理第一階段時，隨著分子量的降低，其分子內氫鍵發生輕微變化從而產生較多游離的羥自由基和氨基；同時在相同質量濃度下，較低分子量多糖含有相對較多的還原性糖；然而在超聲處理的第二階段，隨著超聲降解處理巖藻多糖的深入，其對多糖分子量的降解速率降低，對多糖結構的破壞性增加從而產生更多的自由基，使得其抗氧化活性降解，由此表明控制超聲處理時間對多糖分子量和抗氧化活性至關重要。Tang等[23]采用超聲波降解處理青錢柳葉多糖后，與未降解多糖相比，超聲波降解后多糖中糖含量、糖醛酸含量和蛋白含量沒有發生顯著改變，而其單糖阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的組成比例由1.0∶4.6∶3.5∶4.5變為1.0∶5.9∶3.9∶4.4，而超聲波降解后多糖具有更好的DPPH清除活力和羥自由基清除活力，提示多糖中單糖的組成比例可能與其抗氧化活性密切相關。

3.2 超聲波處理對多糖抗腫瘤活性的影響

抗腫瘤活性是多糖的一個重要生物活性，其機制是通過多糖的免疫調節作用激活免疫細胞，誘導多種細胞因子和細胞因子受體基因的表達，增強機體抗腫瘤相關的免疫功能，從而間接抑制或直接殺死腫瘤細胞。Yu等[24]發現未經超聲波降解條斑紫菜多糖和經超聲波降解多糖對胃癌細胞SGC7901最大抑制率分別為12.5%和32.5%；而對95D細胞最大抑制率分別為18%和21%。據報道，多糖的抗增殖活性主要與多糖分子量、化學成分、主鏈結構和支化度密切相關，其中多糖分子量對其抗增殖活性具有顯著影響，可能是由于分子量的降低能夠增強多糖硫酸基團與腫瘤細胞蛋白之間的相互作用。Zhu等[25]以古尼蟲草多糖作為研究對象，通過正交試驗設計考察超聲功率、超聲時間和多糖濃度對降解古尼蟲草多糖抗腫瘤活性的影響，發現當超聲功率為400 W，超聲時間為15 min，多糖濃度為1 g/L降解處理的古尼蟲草多糖抗腫瘤活性達到最大，其對H22腫瘤細胞的抑制率可達83.3%，超聲波降解顯著提高古尼蟲草多糖抗腫瘤活性，同時發現其對古尼蟲草多糖的單糖殘基和糖苷鍵組成沒有影響，而能夠使得多糖分子量、特性黏度和空間非對稱性降低，表明多糖分子量、特性黏度和空間結構與其抗腫瘤活性具有密切關系。

3.3 超聲波處理對多糖抗菌活性的影響

Liu等[26]通過研究超聲波對4種不同分子量和脫乙酰度殼聚糖（分子量分別為6.55×105、1.54×106、7.75×105、4.47×105kDa；脫乙酰度分別為61.9%、72.1%、87.1%和91.6%。）的影響，發現超聲降解后殼聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗增殖活性增加；表明其抗菌活性與殼聚糖分子量的大小密切相關。另外多糖發揮抗菌活性主要作用的靶點可能為細菌細胞壁，胞質膜和DNA等，從而能夠解決耐藥性的問題，為開發可食用抗菌劑提供一定的應用價值。

3.4 超聲波處理對多糖免疫調節活性的影響

多糖發揮免疫調節活性主要通過誘導產生多種細胞因子，如促進干擾素、白細胞介素等，從而激活巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）和淋巴細胞等免疫細胞，激活網狀內皮系統和補體系統，從而提高機體特異性和非特異性免疫功能，進而發揮其免疫調節活性。Yao等[27]對從薏苡仁種子中分離得到的兩個多糖進行超聲降解處理，發現兩個多糖分子量分別由94.2 kDa和82.3 kDa被降解為63.1 kDa和60.4 kDa；而兩個多糖經超聲波處理后單糖組成沒有發生變化，其單糖摩爾比例發生了細微改變，而經過超聲波降解處理后二者促進小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO、TNF-α和IL-6的能力增加；表明超聲波降解多糖能夠提高多糖的免疫調節活性，且其免疫調節活性可能與多糖中的單糖組成比例密切相關。汪鶴等[21]采用超聲波對密花石斛多糖進行降解發現，與未經超聲波降解組相比，經300 W超聲處理后的多糖促進小鼠脾細胞增殖活性明顯升高，這可能是因為超聲處理使多糖的大聚集體解聚成小的多糖碎片，使其更易進入細胞發揮生物學效應；當超聲功率為600 W時，其活性反而有所降低，表明過高超聲功率降解處理多糖可能會破壞多糖特定的活性結構，進而導致多糖活性下降。肖建輝等[28]在研究超聲波降解處理對古尼蟲草菌絲體多糖免疫調節活性的影響時，發現超聲波處理后的古尼蟲草菌絲體多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖、腹腔巨噬細胞吞噬功能以及細胞毒T淋巴細胞活性的免疫抑制效果明顯增強，尤其在10 μg/mL和100 μg/mL劑量時的抑制效果更好。古尼蟲草菌絲體多糖并不隨超聲波降解時間的延長而提高其免疫抑制活性，降解1 h～2 h和4 h～8 h的抑制效果沒有顯著的差異。

4 展望

多糖已逐漸成為繼蛋白質和核酸之后，人類生命科學研究領域里的又一個新的里程碑，但是由于其分子量范圍廣，結構極為復雜，且生物利用度低等限制了多糖資源的開發與利用；同時大量文獻報道超聲波降解能夠顯著改善多糖的多種生物活性，進而提高多糖藥用價值。其降解機理在于：改善多糖在機體的藥代動力學特性提高其利用度；使得大分子多糖中功能基團得以釋放。但是多糖類物質分子量分布廣泛，空間結構復雜，單糖組成和比例不一，對超聲波功率，超聲時間和超聲溫度對多糖的降解效應研究還不夠全面，因此亟需對降解處理的多糖進行系統研究，由于超聲波降解多糖具有成本低廉，節省能源和時間，操作簡便，無需有毒有害試劑，同時基本不產生廢棄物等諸多優點，因此利用超聲波對多糖進行降解，進而研究其理化性質及生物功能具有十分重要的意義。未來的研究應主要集中于a.研究不同超聲參數（如超聲功率，超聲時間和超聲溫度等）對多糖生物活性的影響機理，特別是與單糖組成的關系；b.關注超聲對多糖空間微結構的影響；超聲降解多糖的研究報道已經取得了一定的成果，但是超聲降解多糖的藥學價值和食品化工領域的應用價值仍有待進一步的研究開發。

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Effect of Ultrasound Degradation on Physical and Chemical Properties and Biological Activity of Polysaccharides

QIU Jun-qiang，ZHANG Hua，LIU Di-di，YUN Ke-li，LI Jing-tong，WANG Zhen-yu*
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

Literatures about ultrasonic degradation of polysaccharides reported in recent years that were reviewed，the effect of ultrasonic degradation on the physical properties，chemical properties and biological activity of polysaccharides were summarized，including antioxidant；antitumor；antibacterial；immunoregulatory activity and so on.In addition，the mechanism of ultrasonic wave was analyzed at the same time，so as to provide a theoretical basis for the study and development of ultrasonic degradation of polysaccharides in the future.

ultrasound；degradation；polysaccharides；physical and chemical properties；biological activity

2016-11-01

黑龍江省教育廳科研項目（12543044）；國家自然科學青年基金（31401483）；黑龍江省博士后基金（LBH-Z14098）；中央高校基本科研業務費專項資金資助（HIT.NSRIF.2017025）

邱軍強（1988—），男（漢），博士研究生在讀，研究方向：天然產物開發。

*通信作者：王振宇（1957—），男（漢），博士生導師，研究方向：天然產物開發與應用。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.041