浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化*

武鳳潔　朱曄榮**　姬曉櫞　楊　琳劉苗苗　李亞輝　白艷玲　王　勇**

（1南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　天津　300071　2天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　天津　300384）

浮萍（Lemna minor）屬于浮萍科（lemnaceae），為最簡(jiǎn)單的單子葉水生漂浮植物，雖然小而簡(jiǎn)單，但是多年來(lái)，圍繞浮萍在植物生理學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域展開(kāi)了眾多理論研究，同時(shí)被廣泛應(yīng)用于除草劑的篩選、水環(huán)境污染程度監(jiān)測(cè)、重要藥用蛋白的生產(chǎn)和水體污染的修復(fù)，同時(shí)因?yàn)楦∑嫉牡矸酆偷鞍缀扛叨婚_(kāi)發(fā)為生物質(zhì)能和優(yōu)質(zhì)蛋白生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)原料［1-5］，使得浮萍成為研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是理論研究和拓寬應(yīng)用開(kāi)發(fā)領(lǐng)域最重要且最有效的手段之一，特別是浮萍藥用蛋白生物反應(yīng)器的建立，高產(chǎn)淀粉或蛋白優(yōu)質(zhì)浮萍株系的獲得等，都離不開(kāi)穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

相對(duì)于其他重要農(nóng)作物和模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系，浮萍侵染體系的研究報(bào)道相對(duì)甚少［6-7］。此外，針對(duì)不同的浮萍屬，其再生和侵染體系的特異性較強(qiáng)，因此不同屬浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，對(duì)于通過(guò)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行浮萍的相關(guān)機(jī)理研究和生產(chǎn)開(kāi)發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要。本研究是在課題組建立和優(yōu)化了浮萍組培體系的基礎(chǔ)上［8］，通過(guò)不同條件的摸索和優(yōu)化，建立了浮萍穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過(guò)基因轉(zhuǎn)化對(duì)浮萍進(jìn)行理論研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料供試材料浮萍由本實(shí)驗(yàn)室保存；轉(zhuǎn)化載體含有擬南芥絲氨酸：乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（Serine：Glyoxylate Aminotransferase,AtAGT1），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建（圖1，見(jiàn)封四）；供試農(nóng)桿菌菌株為EHA105、LBA4404 和 C58C1。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1浮萍轉(zhuǎn)化體系的建立浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立根據(jù)文獻(xiàn)6、文獻(xiàn)7進(jìn)行摸索，首先將浮萍葉狀體放于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上3周后形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以繼代培養(yǎng)后的浮萍愈傷為原材料進(jìn)行浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化，包括共培養(yǎng)和篩選及再生培養(yǎng)。其中，誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基與文獻(xiàn)8相同，共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在B5基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加了100 μmol/L乙酰丁香酮，篩選培養(yǎng)基是在繼代培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和潮霉素，再生培養(yǎng)基是在文獻(xiàn)8中的再生培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和潮霉素。

1.2.2浮萍轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化使用不同種類的農(nóng)桿菌（農(nóng)桿堿型 EHA105、胭脂堿型 GV3101和C58C1）對(duì)浮萍進(jìn)行侵染，統(tǒng)計(jì)侵染3 d后浮萍愈傷的GUS瞬時(shí)表達(dá)率確定哪種農(nóng)桿菌對(duì)浮萍的侵染效率最高。

采 用 0、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的乙酰丁香酮侵染同一批浮萍愈傷，統(tǒng)計(jì)侵染3 d后浮萍愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)率確定乙酰丁香酮的最適作用濃度。

將農(nóng)桿菌活化于分別含有頭孢霉素和羧芐青霉素（0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L）的培養(yǎng)基中，通過(guò)測(cè)定其OD值觀察其抑菌效果。

將野生型愈傷組織和葉狀體放于不同濃度的潮霉素篩選培養(yǎng)基中，觀察野生型愈傷組織和葉狀體的狀態(tài)確定篩選濃度。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定將再生的轉(zhuǎn)基因植株在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，選擇生長(zhǎng)較好的抗性植株，進(jìn)行GUS染色，并采用SDS法提取基因組DNA，采用RNA提取試劑盒提取抗性植株RNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR檢測(cè)出具有目的條帶的為陽(yáng)性植株。其中，RNA提取試劑盒為T(mén)aKaRaMiniBEST，來(lái)源于北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；PCR引物為：

2　結(jié)果與分析

2.1不同類型的農(nóng)桿菌對(duì)浮萍侵染效率的比較

使用不同農(nóng)桿菌對(duì)抗性浮萍愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)率檢測(cè)結(jié)果顯示，農(nóng)桿菌EHA105的侵染效率要高于GV3101和C58C1，因此浮萍遺傳轉(zhuǎn)化確定選用農(nóng)桿菌EHA105（圖2）。

圖2　不同類型的農(nóng)桿菌對(duì)浮萍愈傷組織侵染的瞬時(shí)表達(dá)率比較

2.2乙酰丁香酮濃度對(duì)侵染效率的影響本實(shí)驗(yàn)使用添加不同濃度乙酰丁香酮（0、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L）的菌液侵染浮萍，發(fā)現(xiàn)隨著乙酰丁香酮濃度的升高，侵染效率先升高后降低，當(dāng)乙酰丁香酮濃度為100 μmol/L時(shí)，浮萍的侵染效率最高（圖3）。

圖3　不同濃度乙酰丁香酮對(duì)EHA105介導(dǎo)的浮萍愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率的影響

2.3抗生素濃度的確定頭孢霉素（Cef）和羧芐青霉素（Carb）都具有抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的作用，在侵染過(guò)程中抑制農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)是轉(zhuǎn)基因成敗的關(guān)鍵，因此抗生素濃度的選擇至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用檢測(cè)OD值觀察抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果，由圖4可知，頭孢霉素和羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌EHA105都有很好的抑制效果，濃度為300 mg/L時(shí)可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，所以在侵染浮萍愈傷組織時(shí)選擇頭孢霉素或羧芐青霉素作為抑菌的抗生素，其最佳濃度都選用300 mg/L。

圖4　頭孢霉素和羧芐青霉素對(duì)農(nóng)桿菌EHA105生長(zhǎng)的影響

2.4潮霉素篩選濃度的確定

2.4.1固體潮霉素篩選濃度的確定在篩選培養(yǎng)過(guò)程中，隨著潮霉素濃度的增加，野生型浮萍愈傷組織的存活率不斷下降，當(dāng)潮霉素濃度為60 mg/L時(shí)，愈傷組織的存活率為0，因此，固體潮霉素篩選的最佳濃度為60 mg/L，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　固體潮霉素篩選濃度的確定

2.4.2液體潮霉素篩選濃度的確定使用野生型（WT）和轉(zhuǎn)潮霉素篩選基因的浮萍（OE1）作為實(shí)驗(yàn)材料，當(dāng)用不同濃度的潮霉素進(jìn)行處理后，其表型變化如圖 5～圖 7（見(jiàn)封四），當(dāng) Hyg濃度為1 mg/L時(shí)，WT植株的根變?yōu)榘咨~狀體生長(zhǎng)明顯受到抑制，當(dāng)Hyg濃度大于1 mg/L時(shí)，WT植株根掉落，葉狀體逐漸變白直至死亡。因此篩選轉(zhuǎn)基因植株的最低Hyg濃度為1 mg/L。當(dāng)Hyg濃度為10 mg/L時(shí)，OE1轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)明顯受到抑制，當(dāng)Hyg濃度大于10 mg/L時(shí)，OE1植株的葉狀體變小，而且葉狀體上葉脈凸顯，且根全部變白，因此篩選轉(zhuǎn)基因植株的最高Hyg濃度選用10mg/L。

2.5浮萍轉(zhuǎn)化體系的建立經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，建立了浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化體系。首先用含有OD值為0.5～0.8的農(nóng)桿菌YEP培養(yǎng)液侵染浮萍愈傷組織，于28℃暗培養(yǎng)3 d，超聲清洗愈傷組織后將其放于含有抗性的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)2～3周，直至長(zhǎng)出綠色抗性愈傷組織，隨后將其轉(zhuǎn)接到再生培養(yǎng)基中進(jìn)行再生培養(yǎng)3周，將再生出的苗轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁鑒定。

2.6轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2.6.1抗性苗的篩選將再生出的苗選取單株接入含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，5 d后觀察結(jié)果如（圖6），非轉(zhuǎn)基因植株變白死亡，轉(zhuǎn)基因植株能適應(yīng)液體環(huán)境并進(jìn)行擴(kuò)繁。

2.6.2GUS染色鑒定將已經(jīng)擴(kuò)繁的植株取一部分進(jìn)行GUS染色鑒定,鑒定結(jié)果如（圖7）。由圖7可知,經(jīng)過(guò)潮霉素篩選后的植株全為轉(zhuǎn)基因植株，但是不同轉(zhuǎn)基因株系的基因表達(dá)量存在一定的差異。

2.6.3分子鑒定選取長(zhǎng)勢(shì)良好、基因表達(dá)量高的3株抗性株系提取DNA和RNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示PCR片段大小符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（圖8），初步結(jié)果表明已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。

圖8　轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定圖

3　討論

自從本課題組開(kāi)始建立浮萍再生體系的同時(shí)，也在開(kāi)始摸索建立浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化體系，因?yàn)榭蓞㈤喌母∑嫁D(zhuǎn)化方面的文獻(xiàn)較少，期間發(fā)現(xiàn)有很多因素影響該體系的穩(wěn)定性，通過(guò)多方面的不斷摸索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)除需要注意培養(yǎng)溫度和光周期外，以下幾個(gè)因素的確定也很關(guān)鍵。

3.1侵染方法結(jié)合浮萍的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以選擇的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)主要包括基因槍法、化學(xué)藥劑誘導(dǎo)法、顯微注射法、激光微束穿刺法、多聚陽(yáng)離子基因?qū)敕ā⑥r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法等。鑒于成本、技術(shù)等問(wèn)題，選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的獲得較為普遍，應(yīng)用也比較廣泛，而且前期課題組已經(jīng)建立了浮萍的再生體系。有研究表明不同植物對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性不同，且不同的農(nóng)桿菌對(duì)植物的侵染能力也不同，因此對(duì)于浮萍來(lái)說(shuō)，選擇侵染效率高的農(nóng)桿菌至關(guān)重要。本研究顯示EHA105菌株對(duì)浮萍的侵染效率較其他菌株高。

3.2乙酰丁香酮的使用乙酰丁香酮AS是雙子葉植物細(xì)胞壁合成的前體，通常單子葉植物在轉(zhuǎn)化過(guò)程中不產(chǎn)生AS，所以在轉(zhuǎn)化過(guò)程中外源添加AS可以促進(jìn)根癌農(nóng)桿菌感染單子葉植物。因?yàn)楦∑紝儆趩巫尤~水生植物，因此，在侵染過(guò)程中加入AS是必需的，且合適濃度的AS對(duì)侵染效率很重要，本研究顯示當(dāng)AS濃度為100 μmol/L時(shí)，外源基因?qū)Ω∑嫉那秩拘首罡摺?/p>

3.3篩選抗生素濃度的確定當(dāng)共培養(yǎng)結(jié)束后，植株在篩選培養(yǎng)基中篩選時(shí)，首先需要抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，因此選擇合適的抑菌抗生素和濃度很關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)顯示頭孢霉素和羧芐青霉素都可以在300 mg/L時(shí)發(fā)揮很好的抑菌作用。在抑菌之后的篩選過(guò)程中，篩選具有抗性的轉(zhuǎn)化材料是獲得轉(zhuǎn)基因植株的首要前提，因此植株抗性濃度的確定很重要，如果抗生素濃度過(guò)低，起不到篩選的作用，會(huì)出現(xiàn)大量假陽(yáng)性植株，加大后期的工作量；若抗生素濃度太高，會(huì)將抗性植株也殺死，導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化不能順利進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)以潮霉素的研究顯示，60 mg/L和10 mg/L分別是浮萍固體和液體潮霉素篩選的最佳濃度。

［1］朱曄榮,馬榮,劉清岱,等.浮萍相關(guān)研究的幾方面重要進(jìn)展.生物學(xué)通報(bào)，2010，45（4）:4.

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［8］王勇,楊琳,朱曄榮,等.高效浮萍再生體系的建立:中國(guó),CN102487827A[P]2013-5-6.