“菊花組織培養(yǎng)”實(shí)驗(yàn)選取不同部位為外植體的結(jié)果比較

石虹梅　俞明月

（江蘇省蘇州中學(xué)　江蘇蘇州　215007）

“植物組織培養(yǎng)”技術(shù)在人教版必修1“細(xì)胞的生命歷程”這一章節(jié)中有介紹，美國(guó)科學(xué)家斯圖爾德利用胡蘿卜組織甚至細(xì)胞培養(yǎng)成了完整的植株；選修3專題2又一次提及植物組織培養(yǎng)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)；選修1生物技術(shù)實(shí)踐中將植物的組織培養(yǎng)技術(shù)列為一個(gè)專題。雖然“植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)”并未列在高考說明中，但是此實(shí)驗(yàn)對(duì)于學(xué)生理解細(xì)胞的增殖分化、植物激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，以及無(wú)菌操作、植物生長(zhǎng)發(fā)育中影響的因素等都是一次很好的體驗(yàn)探索活動(dòng)。同時(shí)，也讓學(xué)生體會(huì)實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)性，對(duì)于提升學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)都有很大的幫助。筆者在多年的植物組織培養(yǎng)的中學(xué)教學(xué)實(shí)踐研究中，獲得了一些經(jīng)驗(yàn)體會(huì)，希望能為植物組織培養(yǎng)的中學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

選取菊花的不同部位為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的結(jié)果比較。

2　實(shí)驗(yàn)器具與材料

高壓蒸汽滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱、無(wú)菌操作臺(tái)、MS培養(yǎng)基、6-BA溶液、NAA溶液、蒸餾水、NaOH溶液、培養(yǎng)瓶、量筒、燒杯、酒精燈、電爐、尖嘴鑷、剪刀、培養(yǎng)皿、pH精密試紙、菊花無(wú)菌苗等。

3　實(shí)驗(yàn)操作

1）制備培養(yǎng)基。配制MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基 500 mL,瓊脂每升 7 g［1］，攪拌均勻。調(diào)節(jié)pH為5.6～5.8，分裝至15個(gè)100 mL的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)基與接種時(shí)所需的剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿等工具放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌20 min。

2）接種。將滅菌的培養(yǎng)基及操作工具放入無(wú)菌操作臺(tái)，打開鼓風(fēng)機(jī)，紫外燈照射0.5 h后進(jìn)行接種。接種前，無(wú)菌苗培養(yǎng)瓶、工作臺(tái)消毒后，點(diǎn)燃酒精燈，所有操作均在酒精燈附近進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分3組，每組5瓶。選取生長(zhǎng)健壯的菊花嫩枝，取帶芽的莖段 3～4 mm、 節(jié)間中段 3～4 mm、（5×5）mm 左右的葉片小塊，分別接種到培養(yǎng)基中。標(biāo)記接種日期和相關(guān)信息。

3）培養(yǎng)。將接種好的培養(yǎng)瓶放在光照培養(yǎng)箱中25℃、12 h光照/d培養(yǎng),每隔7 d觀察記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象（圖1～圖3為外植體初始狀態(tài)，本文附圖見封四）。

4　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1）愈傷組織的誘導(dǎo)。外植體在MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后觀察到愈傷組織，4周后愈傷組織明顯（圖4～圖6）。

重復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，有些帶芽的外植體腋芽生長(zhǎng)比較快，愈傷組織形成不明顯。

2）愈傷組織的再分化。上述愈傷組織在培養(yǎng)6周后觀察到有再分化形成叢芽，8周后增大明顯（圖 7～圖 9）。

重復(fù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，葉片的愈傷組織再分化形成叢芽成功率很低，常常是愈傷組織長(zhǎng)到一定程度不再生長(zhǎng)也不分化，最后死亡。

在本實(shí)驗(yàn)的激素條件下，菊花的帶芽莖段、節(jié)間中段、葉片作為外植體均有觀察到脫分化形成愈傷組織，但是帶芽莖段有一部分直接由腋芽發(fā)育長(zhǎng)大，由愈傷組織再分化形成叢芽觀察不明顯；葉片形成的愈傷組織多數(shù)并沒有再分化形成叢芽，最后死亡；而節(jié)間中段的脫分化、再分化過程明顯且成功率高。

5　進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

菊花帶芽莖段、節(jié)間中段及葉片在不添加植物激素的情況下，組織培養(yǎng)能否成功？實(shí)驗(yàn)材料與方法同上，結(jié)果表明，帶芽莖段直接由腋芽發(fā)育成幼苗，未能觀察到脫分化現(xiàn)象（圖10），長(zhǎng)成的幼苗基本無(wú)分枝或分枝較少（圖13）；節(jié)間中段先脫分化形成愈傷組織（圖11），然后再分化形成叢芽（圖14），但是有部分莖段在培養(yǎng)2周后開始褐化，最后死亡；葉片在培養(yǎng)2周后均逐漸死亡（圖12）。

事實(shí)上，適合菊花芽、莖、葉組培的激素濃度和比例都不相同，哪種激素配比適合菊花的哪個(gè)器官也可以進(jìn)行探究。

6　教學(xué)建議

高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)要能全面開展，重要的是實(shí)驗(yàn)有意義、容易開展、成功率高，因此在植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的摸索中,提出以下建議供中學(xué)教師參考。

1）培養(yǎng)基的配制。首先配制MS培養(yǎng)基比較繁瑣，且保存時(shí)間較短，建議使用試劑盒。在制備固體培養(yǎng)基時(shí)，瓊脂的含量會(huì)影響培養(yǎng)基的硬度，培養(yǎng)基配好后分裝時(shí)，要充分搖勻，以免瓊脂不均勻而使得部分瓶中培養(yǎng)基未凝固，而部分瓶中培養(yǎng)基又太硬。此外，pH值也會(huì)影響培養(yǎng)基的凝固，所以滅菌前一定要調(diào)節(jié)pH值。

2）外植體的選擇。高中生物學(xué)課堂時(shí)間比較緊張，為節(jié)約時(shí)間，建議學(xué)生實(shí)驗(yàn)采用無(wú)菌苗，省略外植體消毒步驟。本研究在學(xué)生實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)過外植體消毒獲得組培材料，成功率比較低，多數(shù)都因污染而失敗。

此外建議選擇菊花的節(jié)間中段為外植體,觀察到脫分化、再分化現(xiàn)象明顯，且成活率高。

3）實(shí)驗(yàn)過程。建議實(shí)行分組實(shí)驗(yàn)，每組人員分工合作：接種操作、手機(jī)拍照錄像、觀察記錄、交流討論等，人人參與，最后完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，匯報(bào)交流。整個(gè)班級(jí)小組可以進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，也可以分工進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)，以探究不同的問題，例如菊花不同部位作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的比較、有無(wú)植物激素對(duì)菊花組織培養(yǎng)的影響、植物激素比例對(duì)菊花組織培養(yǎng)的影響等。鼓勵(lì)學(xué)生提出問題、作出假設(shè)、設(shè)計(jì)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證自己的推測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的任何問題都是教學(xué)的一種資源，不可輕易否定或忽視。

［1］秘嘉.MS培養(yǎng)基發(fā)硬問題淺析.現(xiàn)代閱讀,2012(5):5.

［2］周鑫.植物組織培養(yǎng).北京.航空工業(yè)出版社,2012:142.