miR-219-5p對胰腺癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及機制

李麗平，徐丹，葉俊，吳舜，馬松林( 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院新洲院區，武漢430000； 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院)

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miR-219-5p對胰腺癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及機制

李麗平1，徐丹2，葉俊1，吳舜1，馬松林2
(1 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院新洲院區，武漢430000；2 華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院)

目的 探討miR-219-5p對胰腺癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響及機制。方法 采用實時熒光定量PCR技術(qPCR)檢測miR-219-5p在胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1及Bxpc-3和正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7中的表達。選取Panc-1細胞系，分成兩組，對照組(NC組)轉染陰性對照序列scramble，miR-219-5p組轉染miR-219-5p mimics,MTT實驗和流式細胞儀分析兩組細胞增殖和凋亡情況，采用Transwell實驗測定兩組細胞侵襲能力，Western blotting法檢測表皮生長因子受體(EGFR)和裂解型Caspase 3(Cleaved Caspase-3)蛋白表達。結果 miR-219-5p在胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1及Bxpc-3中的相對表達量低于正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7(P均<0.01)；miR-219-5p組在72、96及120 h 490 nm處的OD值低于NC組(P均<0.01)，細胞凋亡率高于NC組(P均<0.01)；miR-219-5p組、NC組細胞侵襲數分別為(75.3±6.9)、(172.5±10.5)個/視野，兩組細胞侵襲數比較，P<0.01；miR-219-5p組、NC組EGFR相對表達量分別為0.31±0.09、1.0，兩組比較，P<0.01；miR-219-5p組、NC組Cleaved Caspase 3蛋白相對表達量分別為2.7±0.15、1.0，兩組比較，P<0.01。結論 miR-219-5p在胰腺癌細胞系中呈低表達，miR-219-5p過表達可抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡；其機制可能與miR-219-5p下調EGFR蛋白和上調Cleaved Caspase-3蛋白表達有關。

胰腺癌；細胞增殖；細胞侵襲；細胞凋亡；微小RNA-219-5p

MicroRNA(miRNA)是一類天然存在的長19～25 nt的非編碼小分子RNA，通常與靶基因mRNA 3′UTR結合而阻止轉錄或降解mRNA[1]。miRNA在細胞分化、生長、死亡等生長發育過程中發揮重要作用[2]。目前已證實，miRNA的異常表達與多種疾病有關，特別是在腫瘤領域。多數miRNA在腫瘤組織中表達下降，可能作為癌基因或抑癌基因與腫瘤發生發展密切相關[3]。胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，具有預后差、易轉移、惡性程度高等特點，全球范圍內胰腺癌在所有腫瘤中病死率占第八位，每年約有266 000例死于胰腺癌[4]。目前已發現有多種miRNA在胰腺癌中表達下調，如miRNA-96、miRNA-141等[5,6]。miRNA-96通過直接靶向KRAS降低胰腺癌細胞遷移和侵襲[5]。miR-141表達下調與胰腺癌腫瘤大小、TNM分期及轉移有關[6]。研究發現，miR-219-5p過表達抑制膠質母細胞瘤等腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移過程[7]。miR-219-5p可能作為抑癌基因參與腫瘤的生長過程，但對于miR-219-5p是否參與胰腺癌發展，目前尚不清楚。2016年1月～2017年1月，我們觀察了miR-219-5p在胰腺癌細胞系中表達及其對細胞增殖、侵襲、凋亡能力的影響，同時研究了對EGFR、Cleaved Caspase-3蛋白表達的調控作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1、Bxpc-3及正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7均購自武漢大學醫學院實驗醫學中心，RPMI1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶及TRIzol均購自美國BD公司，EGFR、Caspase3及GAPDH均購自Cell signaling公司，羊抗兔二抗購自武漢博士德生物科技有限公司，miRNA-219-5p mimics及scramble均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養、轉染及分組 將胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1、Bxpc-3及正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7加入到RPMI1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，經48 h后消化傳代。將Panc-1細胞系分成兩組，NC組和miR-219-5p組，采用Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, USA)分別轉染miRNA-219-5p scramble及mimics，miR-219 mimics 轉染序列：miR-219-5p mimics sense 5′-AAAAGAATTCCCACTTCCCACTCCAGACATT-3′，antisense 5′-AAAGCGGCCGCCCCTCACTTCTCCGTAACCC-3′。

1.3 miR-219-5p表達檢測 采用All-in-One microRNA抽提試劑盒提取Panc-1、AsPC-1、Bxpc-3及HPDE6-C7細胞系的miRNAs，ABI Prism 7700 system 的SYBR Green Reagents (TaKaRa, Tokyo, Japan)定量real-time PCR(qRT-PCR)，在ABI 7500實時定量PCR儀中，以U6小核RNA作為內參，使用2-ΔΔCt方法定量，量化miR-219-5p相對表達水平。

1.4 細胞增殖情況檢測 采用MTT法。將NC組和miR-219-5p組細胞經培養后消化成單細胞懸液，按2×103/孔接種于96孔板上，按200 μL每孔標準培養，在培養后0、24、48、72、96及120 h后，按每孔20 μL的標準加入MTT溶液，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度，繪制MTT增殖曲線。

1.5 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。用Annexin V/PI 染色檢測，將NC組和miR-219-5p組細胞消化成單細胞懸液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重懸，加入相應比例的Annexin V抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液及PI染料，流式細胞儀檢測Annexin V陽性細胞比例確定細胞凋亡情況。

1.6 細胞侵襲情況檢測 采用Transwell法。NC組和miR-219-5p組各取2×104個細胞，接種于碳酸磷脂表面，于37 ℃下培養24 h，用1%多聚甲醛與膜下面的細胞結合并用0.2%結晶紫溶液染色，隨機取10個視野(200×),計算穿過膜的細胞數量，實驗重復3次，取平均值。

1.7 EGFR和Cleaved Caspase-3蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將NC組和miR-219-5p組細胞經RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min后，變性、上樣，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規濕法轉膜，加入EGFR、Cleaved Caspase-3及GAPDH一抗，濃度為1∶300,一抗孵育過夜，二抗(1∶500)于37 ℃孵育4 h，PBST漂洗3次，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對蛋白質印跡條帶進行定量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白測定值/ GAPDH，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 不同胰腺癌細胞系中miR-219-5p表達比較 qPCR結果顯示，胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1及Bxpc-3 miR-219-5p的相對表達量分別為0.27±0.023、0.33±0.029、0.43±0.033，正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7中miR-219-5p相對表達量為1.0，胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1及Bxpc-3中miR-219-5p的相對表達量均低于正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7(P均<0.01)。

2.2 各組細胞增殖情況及細胞凋亡率比較 qPCR測定miR-219-5p組miR-219-5p相對表達量為10.25±0.45，NC組為1.0，兩組比較，P<0.01。MTT實驗檢測結果顯示，miR-219-5p組與NC組0 h時490 nm處OD值分別為0.17±0.02、0.16±0.04，兩組比較，P>0.05；24 h時OD值分別為0.28±0.05、0.27±0.04，兩組比較，P>0.05；48 h時OD值分別為0.43±0.07、0.66±0.09，兩組比較，P>0.05；72 h時OD值分別為0.73±0.09、1.49±0.13，兩組比較，P<0.05；96 h時OD值分別為1.29±0.17、2.45±0.26，兩組比較，P<0.01；120 h時OD值分別為2.22±0.21、3.83±0.29，兩組比較，P<0.001。流式細胞術檢測結果顯示，miR-219-5p組、NC組細胞凋亡率分別為(15.75±2.42)%、(5.5±0.70)%，兩組細胞凋亡率比較，P<0.01。

2.3 miR-219-5p組、NC組細胞侵襲情況比較 Transwell實驗顯示，200倍視野下，miR-219-5p組、NC組穿膜細胞數分別為(75.3 ± 6.9)、(172.5±10.5)個/視野，兩組比較，P<0.01。

2.4 miR-219-5p組、NC組EGFR和Cleaved Caspase-3蛋白表達比較 miR-219-5p組、NC組EGFR相對表達量分別為0.31±0.09、1.0，兩組比較，P<0.01；miR-219-5p組、NC組Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量分別為2.7±0.15、1.0，兩組比較，P<0.01。

3 討論

胰腺癌是常見的惡性腫瘤之一，在癌癥病死率中位列第四[8]。目前針對胰腺癌的治療以傳統手術、放療、化療為主，但缺乏更有效的治療方式[9]。miRNA是一類與腫瘤密切相關的小分子RNA，目前已有多個miRNA被證實參與胰腺癌細胞轉移、增殖、凋亡等過程，如miRNA-96、miRNA-141等[5,6]。miRNA-219-5p已被證實與多種腫瘤發生發展有關，通過靶向雌激素受體抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移，促進凋亡[10]；通過靶向PRKCI抑制舌鱗狀細胞癌生長和轉移[11]等。胰腺癌特異型性miRNAs及其靶點的識別有助于了解其在腫瘤發生中的作用。本研究發現miR-219-5p在胰腺癌細胞系中表達下降，過表達后能明顯抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲能力，并誘導細胞凋亡，這一機制是通過降低EGFR、提高Cleaved Caspase-3蛋白表達實現的。

信號轉導通路紊亂可致細胞增殖失控，是腫瘤發生發展的重要原因[12]。PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK信號轉導通路通常在細胞內發揮抑制凋亡、促進增殖的作用，其過度激活極易導致腫瘤發生，他們往往是由發生基因突變的信號通路組成因子或上游的受體酪氨酸激酶所介導[13]。受體酪氨酸激酶包括EGFR、血小板衍化生長因子、纖維細胞生長因子、胰島素受體等[14]。研究顯示，45%的膠質母細胞瘤患者受體酪氨酸激酶介導的信號通路被激活是由于EGFR表達失調所致[7]。EGFR在胰腺癌等多種實體瘤中表達過度的現象廣泛存在，表明其表達異常與腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲有關[15]。EGFR異常表達可能由miRNA失調引起，且已被驗證為多個miRNA的靶基因。如在膠質母細胞瘤中，miRNA-7通過抑制EGFR表達和阻礙PI3K/Akt信號通路激活，從而降低細胞存活率和侵襲能力[16]。更重要的是，在膠質母細胞瘤中miR-219-5p通過直接綁定結合EGFR 3′UTR位點而降低EGFR表達，使EGFR介導的PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK信號途徑受抑制，由此降低細胞增殖、生長和轉移能力[7]。本研究中，miR-219-5p過表達可引起EGFR蛋白水平降低，我們猜測在胰腺癌中miR-219-5p是直接與EGFR基因3′UTR位點特異性結合，負調控EGFR轉錄后水平，抑制了PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK信號通路，因而減弱細胞增殖和侵襲能力。

細胞凋亡是細胞程序性死亡，是調控機體發育、清除受損細胞、維持內環境的重要機制，其失衡是腫瘤發生發展的一大重要因素。細胞凋亡主要通過死亡受體介導的細胞凋亡途徑、線粒體途徑、內質網途徑三種方式[17]。Caspase-3是這三種通路的關鍵執行酶，細胞在受到刺激信號后經過一系列級聯反應使無活性的Procaspase-3被激活，裂解為有活性的Caspase-3，最終誘導細胞凋亡[18]。本研究中，miR-219-5p過表達誘導胰腺癌細胞凋亡，同時Cleaved Caspase-3表達量上升，說明Caspase-3被激活，細胞凋亡被誘導。我們猜測，miR-219-5p誘導細胞凋亡可能是通過死亡受體途徑、線粒體途徑或內質網途徑，亦可能同時執行兩種或三種途徑，但具體的作用途徑還需進一步研究。

綜上所述，miR-219-5p在胰腺癌中作為抑癌基因是通過上調EGFR蛋白、下調Caspase-3蛋白參與抑制細胞增殖和侵襲、促進細胞凋亡。該基因功能的鑒定有望為胰腺癌靶向治療提供新的靶點，為腫瘤治療提供新的途徑。

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Effects of miR-219-5p on proliferation, apoptosis, and invasion of pancreatic carcinoma cells

LILiping1,XUDan,YEJun,WUShun,MASonglin

(1TheCentralHospitalofWuhanAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430000,China)

Objective To investigate the effects of miRNA-219-5p on the proliferation, apoptosis, and invasion of pancreatic carcinoma cells and its mechanism. Methods Real-time fluorescence quantitative PCR (qPCR) was carried out to determine miR-219-5p expression in the pancreatic carcinoma cell lines Panc-1, AsPC-1, and Bxpc-3 and normal pancreatic ductal epithelial cell line HPDE6-C7. Further, Panc-1 cells were chosen and were divided into two groups: the normal control group (NC group) (transfection with miR-219-5p scramble) and miR-219-5p group (transfection with miR-219-5p mimics). The cell proliferation and apoptosis were detected by MTT assay and flow cytometry. The invasion ability was checked by transwell assay. The expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and Cleaved Caspase-3 proteins was examined by Western blotting. Results MiR-219-5p expression was lower in pancreatic carcinoma cell lines Panc-1, AsPC-1, and Bxpc-3, as compared with that in the pancreatic ductal epithelial cell line HPDE6-C7 (allP<0.01). The OD490nm of the miR-219-5p group was significantly lower than that of the NC group at 72, 96, and 120 h (allP<0.01); the apoptosis rate was higher (allP<0.01). The invasive cells were (75.3±6.9)/Hp in the miR-219-5p group, which was significantly lower than that [(172.5±10.5)/Hp] in the NC group (P<0.01). The expressive level of EGFR in the miR-219-5p group was significantly lower than NC group (0.31±0.09 vs. 1.0,P<0.01). The expression of Cleaved Caspase-3 was up-regulated in the miR-219-5p group as compared with that of NC group (2.7±0.15 vs. 1.0,P<0.01).Conclusions The miR-219-5p is lowly expressed in pancreatic carcinoma cell lines. The over-expression of miR-219-5p can inhibit the proliferation and invasion of pancreatic carcinoma cells, and induce the apoptosis, possibly though the down-regulated protein expression of EGFR and up-regulated protein expression of Cleaved Caspase-3.

pancreatic carcinoma; cell proliferation; cell invasion; apoptosis; miRNA-219-5p

湖北省自然科學基金面上項目(CFB578)；武漢市衛計委課題(WX14A04)。

李麗平(1977-)，在讀碩士，住院醫師，主要研究方向為胰腺腫瘤的基礎與臨床。E-mail:lipingli2017@126.com

馬松林(1979-)，碩士，主治醫師，主要研究方向為胰腺腫瘤的基礎與臨床。E-mail:songlinma8887@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.004

R735.9

A

1002-266X(2017)25-0012-04

2017-04-01)