綠原酸對人白血病阿霉素耐藥株K562/ADM細胞多藥耐藥的影響及其機制

任秀敏，賈秀紅，朱聰，段培鋒(濱州醫學院附屬醫院，山東濱州 256603)

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綠原酸對人白血病阿霉素耐藥株K562/ADM細胞多藥耐藥的影響及其機制

任秀敏，賈秀紅，朱聰，段培鋒
(濱州醫學院附屬醫院，山東濱州 256603)

目的 觀察綠原酸對人白血病阿霉素耐藥株K562/ADM細胞多藥耐藥的影響，進一步探討其作用機制。方法 取對數生長期的人白血病細胞株K562細胞和K562/ADM細胞，將不同濃度(2～64 μmol/L))的綠原酸作用于K562/ADM 細胞24 h后，采用MTT法檢測綠原酸內在細胞毒性及對阿霉素(Adr)的增敏作用，并計算逆轉倍數；流式細胞術檢測經綠原酸處理后K562/ADM 細胞內Adr和羅丹明123平均熒光強度;Western blotting法檢測細胞多藥耐藥相關蛋白(MRP1)、P糖蛋白(P-gp)、t-Akt、p-Akt蛋白表達。結果 篩選出細胞抑制率<10%時的綠原酸濃度為4 μmol/L以內，即為無毒劑量。綠原酸2、4 μmol/L及Adr作用K562/ADM細胞后的逆轉倍數分別為1.65、2.21倍。K562/ADM細胞內Adr平均熒光強度為184±22，用2、4 μmol/L綠原酸處理K562/ADM細胞，加入Adr后，其熒光強度分別為223±26、326±35，綠原酸干預前后熒光強度比較，P均<0.05。綠原酸干預K562/ADM后細胞內MDR1、p-Pg、t-Akt、p-AKT蛋白表達受抑(P均<0.05)，2、4 μmol/L綠原酸處理K562/ADM細胞24 h后，MRP1、P-gp、p-Akt蛋白相對表達量分別為(77.34±1.143)%、(59.63±0.658)%、(37.41±0.575)%和(66.12±1.102)%、(51.33±0.658)%、(32.41±0.575)%。結論 綠原酸體外可有效逆轉K562/ADM細胞多藥耐藥，其相關分子機制可能通過下調P13K/Akt信號通路抑制MRP1、P-gp蛋白表達實現。

白血病；綠原酸；多藥耐藥；K562/ADM細胞

白血病占所有惡性腫瘤的4%，目前治療的主要手段仍是化療，但由于多藥耐藥(MDR)的產生，白血病5年生存率僅為50%，因此，逆轉MDR是白血病治療中亟待解決的問題[1]。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的縮酚酸，是植物在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的苯丙素類化合物，具有抗氧化、抑菌、抗炎、降糖、免疫調節等多種功效[2]。近年研究發現，綠原酸能抑制乳腺癌、結直腸癌、肝癌等腫瘤細胞的生長[3～6]，但綠原酸是否具有逆轉白血病MDR功能，目前尚不明確。2015年10月，我們體外觀察綠原酸對人慢性髓系白血病細胞阿霉素耐藥株K562/ADM MDR的逆轉作用，并分析相關作用機制，為綠原酸與其他化療藥物聯合治療白血病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料綠原酸(純度>98%，大連美侖生物技術有限公司),人慢性髓系白血病細胞株K562(濱州醫學院中心實驗室)，人慢性髓系白血病細胞阿霉素耐藥株K562/ADM (中國醫學科學院血液學研究所)，RPMI1640培養基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，四甲基唑藍(MTT，美國Sigma公司)，用PBS配成5 g/L、4 ℃避光保存，羅丹明123(Rhl23，華美公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Gibco公司)，阿霉素(Adr，北京博奧森生物技術有限公司)，兔抗多藥耐藥相關蛋白(MRP1)、P糖蛋白(P-gp)、t-Akt、p-Akt、GADPH多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.2 耐藥倍數測定 采用MTT法。將K562、K562/ADM細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養基中，培養于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的無菌培養箱，每2～3 d傳代1次，用4 μg/mL的Adr維持K562/ADM細胞的耐藥性，實驗開始前1周用不含Adr的RPMI1640培養基進行常規培養。取對數生長期的K562細胞和K562/ADM細胞，接種于96孔板，每孔細胞數均為4×103/孔，分別加入不同濃度Adr(K562細胞：0.2～3.2 mg/L，K562/ADM細胞：8～128 mg/L)，每個濃度設5個平行復孔，另設空白組(未加藥)，放于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的無菌培養箱培養24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL溶液培育4 h，4 ℃平板離心機離心10 min后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光振蕩裂解15 min后，于570 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值。計算半數抑制濃度(IC50)和耐藥倍數(耐藥倍數=耐藥細胞株IC50/敏感細胞株IC50)，獨立重復實驗3次。

1.3 綠原酸無毒劑量的篩選 取對數生長期的K562/ADM細胞，隨機分為實驗組與對照組，接種于96孔培養板中，細胞數4×103/孔，實驗組加入不同濃度的綠原酸(2、4、8、16、32、64 μmol/L)100 μL，對照組予等量RPMI1640培養基,培養24 h后，測570 nm波長處的A值。計算綠原酸各個濃度下的細胞抑制率：細胞抑制率(IR)=[1-(實驗組A均值/對照組A均值)]×100%，篩選出細胞抑制率<10%時的綠原酸濃度，即為無毒劑量。獨立重復實驗3次。

1.4 逆轉耐藥倍數檢測 采用MTT法。K562/ADM細胞接種和培養方法同1.2，每孔加入不同濃度的Adr(2、4、8、16、32 μg/mL)，分單用Adr組，Adr與不同濃度綠原酸(2、4 μmol/L)合用組，MTT法測定吸光度(A)值。計算逆轉倍數，逆轉倍數=單用Adr IC50/Adr與綠原酸合用IC50。

1.5 Adr胞內蓄積實驗 參考文獻[7,8]方法，取對數生長期K562/ADM細胞，調整細胞濃度2×105/mL，隨機分為四組，K562/ADM組、K562/ADM+Adr組、K562/ADM+綠原酸(2 μmol/L)+Adr組、K562/ADM+綠原酸(4 μmol/L)+Adr組加入相應濃度藥物,接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2無菌培養箱中避光培育1 h，加入終濃度為3 mg/L Adr，繼續培養1 h后，用冷PBS洗滌2次除去游離Adr，用流式細胞儀檢測細胞內Adr激發的平均熒光強度,激發波長485 nm，發射波長585 nm，以相對熒光強度表示Adr濃度。獨立重復實驗3次。

1.6 P-gp功能檢測 采用羅丹明蓄積和外排實驗，對照組加入終濃度為2 mg/L 羅丹明123(Rh123)，實驗組在對照組基礎上分別加入濃度為2、4 μmol/L的綠原酸，放于37 ℃、5%CO2培養箱中避光孵育1.5 h后，冷PBS洗滌2次除去游離Rh123，流式細胞儀測定細胞內Rh123被激發的相對熒光強度(激發波長485 nm，發射波長535 nm)，以平均熒光強度(MFI)表示Rh123濃度。獨立重復實驗3次。

1.7 MRP1、P-gp、t-Akt，p-Akt表達檢測 采用Western blotting法。取對數生長期K562/ADM細胞，5×105/孔接種于6孔板，不加或加不同濃度(2、4 μmol/L)的綠原酸培養24 h后，提取細胞總蛋白，煮蛋白后取50 μg進行電泳，轉膜，用7.5%的脫脂奶粉封閉2 h后，TBST洗膜，加1∶200稀釋的兔抗人多克隆抗體P-gp、MRP1、p-Akt及1∶500稀釋的兔抗人多克隆抗體GADPH，置4 ℃搖床過夜，用化學發光試劑顯色，使用Chemiscope 軟件分析圖像，MRP1、P-gp、t-Akt、p-Akt蛋白的相對表達量用MRP1、P-gp、t-Akt、p-Akt灰度值/GADPH灰度值表示。獨立重復實驗3次。

2 結果

2.1 K562/ADM細胞的耐藥倍數 K562、K562/ADM細胞經Adr處理24 h后，IC50分別為(1.68±0.79)、(61.38±2.23)μmol/L，與敏感株K562細胞相比，耐藥株K562/ADM細胞對Adr的殺傷作用表現出明顯的耐受性，耐藥倍數為36.54倍。

2.2 篩選出的綠原酸無毒劑量 綠原酸在所有測試劑量下對K562/ADM細胞的生長抑制作用呈劑量依賴性，濃度為2 μmol/L生長抑制率<5%,濃度為4 μmol/L生長抑制率<10%。篩選出細胞抑制率<10%時的綠原酸濃度為4 μmol/L以內，即為無毒劑量。

2.3 綠原酸對K562/ADM細胞耐Adr的逆轉倍數 相同Adr濃度劑量下，與綠原酸合用后，Adr對K562/ADM耐藥株的細胞抑制作用提高，Adr對耐藥白血病細胞的毒性增強，且增強效果與綠原酸呈濃度依賴性。K562/ADM + Adr組、K562/ADM+綠原酸(2 μmol/L)+ Adr組、K562/ADM +綠原酸(4 μmol/L)+ Adr組IC50分別為(55.98±2.31)、(32.54±1.48)、(25.38±0.98)μmol/L，K562/ADM +綠原酸(2 μmol/L)+ Adr組、K562/ADM+綠原酸(4 μmol/L)+Adr組逆轉倍數分別為1.65、2.21倍。

2.4 細胞內Adr激發的平均熒光強度比較 K562細胞內Adr平均熒光強度明顯高于K562/ADM細胞，K562/ADM細胞內Adr平均熒光強度為184±22。用2、4 μmol/L綠原酸處理K562/ADM細胞，加入Adr后，其熒光強度分別為223±26、326±35，2、4 μmol/L綠原酸可顯著增加K562/ADM細胞內Adr蓄積，分別為對照組1.21和1.77倍，呈劑量依賴性。

2.5 P-gp功能變化 將K562/ADM與Rh123共同孵育后，K562/ADM細胞內Rh123熒光強度為513±18，綠原酸處理K562/ADM細胞，加入Rh123后，測定其熒光強度，分別為713±25、929±37，綠原酸各濃度(2、4 μmol/L)均可顯著增加K562/ADM細胞內Rh123蓄積，分別為對照組的1.39、1.81倍，并呈劑量依賴性。

2.6 綠原酸干預后K562/ADM細胞MRP1、P-gp、p-Akt蛋白表達變化 綠原酸干預后細胞內MDR1、p-Pg、t-Akt、p-AKT蛋白表達受抑，綠原酸(2、4 μmol/L)處理K562/ADM細胞24 h后，MRP1、P-gp、p-Akt蛋白相對表達量分別為(77.34±1.143)%、(59.63±0.658)%、(37.41±0.575)%和(66.12±1.102)%、(51.33±0.658)%、(32.41±0.575)%。

3 討論

白血病是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，化學療法為其治療的重要手段，白血病細胞MDR的產生是導致化療失敗的主要原因[9]，探討白血病的MDR相關機制并尋找有效的逆轉劑有重要意義。中藥毒性低，能與化療藥物聯合使用，是近年國內研究的熱點[10]。綠原酸存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中，具有廣泛的藥理作用。研究發現，綠原酸對乳腺癌、結直腸癌、肝癌具有抑制作用[3～6]，抗腫瘤作用逐漸被重視，但其是否能逆轉白血病MDR尚不清楚。K562/ADM細胞株由逐步增加培養基中阿霉素濃度建立的人白血病耐藥細胞株，能穩定表達P-gp。本實驗結果顯示，K562/ADM細胞經濃度為 2～64 μmol/L的綠原酸處理 24 h 后，細胞生長均不同程度受抑制，并呈劑量依賴性。用MTT法檢測濃度分別為2、4 μmol/L 的綠原酸與阿霉素聯合處理K562/A02細胞后，IC50明顯下降，逆轉倍數分別為1.65、2.21倍，胞內阿霉素和Rh123蓄積實驗顯示，2、4 μmol/L 的綠原酸能增加細胞內阿霉素、Rh123蓄積。上述結果提示綠原酸具有逆轉白血病MDR的作用，但具體作用機制仍不明確。

目前研究表明，化療藥物外排增加是產生MDR的原因之一，其主要機制為ABC轉運子表達增多，如P-gp、MRP1等[8，11]。P-gp位于細胞膜上，是由ABCBl(MDRl)基因編碼的有機陽離子泵，能與蒽環類及鬼臼堿類藥物等多種藥物結合，以耗能方式主動將藥物從細胞泵出，降低細胞內藥物濃度，使其免受化療藥物的殺傷而產生耐藥性；MRP1由MRP1基因編碼，同P-gp具有結構相似性，亦具有將多種化療藥物由胞內轉運至胞外的功能，與臨床耐藥有關[12]。P13K/Akt是細胞內重要的信號傳導通路，在白血病MDR中發揮重要作用，研究發現，在腫瘤細胞中，高活化P13K/Akt信號通路通過上調ABC結合膜蛋白促進藥物外排，尤其與P-gp和 MRP1密切相關，阻斷PI3K/Akt信號通路導致下游P-gp和 MRP1表達下調，增強腫瘤細胞對化學藥物的敏感性[13]。Rh123是P-gp特異性熒光底物，能間接反映化合物與P-gp結合活性及對P-gp功能抑制作用。我們將綠原酸與阿霉素聯合處理K562/ADM細胞后，可增加Rh123在K562/ADM細胞內的蓄積，提示P-gp的外排功能受到抑制，繼而采用Western blotting法在蛋白水平探究綠原酸對P-gp及MRP1表達的影響，結果顯示聯合處理后的K562/ADM細胞內P-gp蛋白和MRP1蛋白表達降低，p-Akt表達降低,提示綠原酸通過PI3K/Akt信號通路下調P-gp和MRP1表達。

綜上所述，綠原酸能抑制K562/ADM細胞生長并逆轉其MDR，作用機制可能是通過PI3K/Akt信號通路下調P-gp和MRP1表達實現。

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山東省自然科學基金資助項目(ZR2014HL032)；山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2014WS0183)。

賈秀紅(E-mail：jiaxiuhong001@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.014

R733.7

A

1002-266X(2017)25-0045-03

2016-11-06)