HBV DNA整合與乙型肝炎、PHC關系的研究進展

吳殿磊,徐光華,劉娜(1西藏民族大學附屬醫院,陜西咸陽7108；延安大學附屬醫院)

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HBV DNA整合與乙型肝炎、PHC關系的研究進展

吳殿磊1,2,徐光華2,劉娜2
(1西藏民族大學附屬醫院,陜西咸陽712082；2延安大學附屬醫院)

乙型肝炎病毒(HBV)是導致慢性肝炎的主要病因,同時亦是原發性肝細胞癌(PHC)的主要危險因素之一，研究證實HBV可通過整合自身基因進入到宿主基因組中或通過其結構蛋白、分泌蛋白,或通過表觀遺傳導致宿主基因突變,突變主要包括肝細胞部分DNA缺失和染色體重排等。HBV DNA整合對病毒本身和宿主肝細胞可產生影響，系列研究表明,乙型肝炎慢性化和PHC的發生發展與HBV DNA選擇性整合可能存在關聯,與乙型肝炎慢性化和PHC相關聯整合位點的鑒定,將為乙型肝炎慢性化機制研究提供新的思路和線索,對未來臨床基因診斷和治療CHB及PHC有指導意義。

乙型肝炎；原發性肝細胞癌；乙型肝炎病毒DNA;整合位點鑒定

HBV是迄今發現最小的不完全環狀嗜肝DNA病毒，HBV感染可致急慢性乙肝，亦是誘發原發性肝細胞癌(PHC)的重要危險因素之一。HBV DNA可通過整合進入到宿主基因組中或通過其編碼的結構蛋白、分泌蛋白,或通過表觀遺傳導致宿主基因突變和染色體重排[1],突變主要包括病毒基因、宿主基因和染色體的變化，HBV DNA整合對病毒本身和宿主肝細胞可產生影響，部分突變與乙肝慢性化和終末期肝病(肝硬化、PHC)有關。現就HBV DNA整合與慢性乙肝、隱匿性HBV感染(OHBI)、PHC的關系綜述如下，以期為乙肝慢性化機制研究及PHC基因診斷和治療提供新的思路和線索。

1 HBV DNA整合概述

雖然HBV是DNA病毒，但因其在復制過程中存在獨特的前基因組反轉錄過程，所以其基因組有機會整合至人基因組中。與逆轉錄病毒的感染不同,HBV DNA整合不是病毒復制所必須,所以HBV基因整合在其自然史中并非常規事件[2,3]。1980年首次在乙肝相關性肝細胞癌中檢測到HBV DNA整合[4]，以后相繼在急、慢性乙肝、肝癌組織中檢測到多種不同形式的HBV DNA整合[3,5～8]。HBV基因整合至宿主基因組中有利于其持久感染,長期的慢性炎癥可致肝細胞生命周期改變和增殖,這就增加了宿主基因組DNA終端的數量,從而有利于HBV DNA整合到宿主基因組中,這一過程拓撲異構酶I是關鍵性因子[9，10]。宿主基因組最常見的改變是倒立重復和缺失[4]。研究表明,HBV基因整合方式分為起始于順向重復序列(DR)1，DR1向負鏈3'端延伸；起始于DR1向負鏈5'端延伸；起始于DR2向負鏈3'端延伸；起始于DR2向負鏈5'端延伸[2,11]。

慢性炎癥或病毒重疊感染可使肝細胞暴露于氧化應激或誘變環境,喪失DNA修復能力,這可能是HBV DNA能整合至宿主基因組的重要原因[9]。HBV整合可誘導宿主基因組相應位置重排或部分缺失[12]。近期研究表明HBV DNA整合并非完全隨機,存在優先選擇性。基因轉位、融合、缺失和廣泛的基因組不穩定性可能是HBV DNA整合的原因,整合后宿主基因組的改變有機會產生選擇性肝細胞克隆,HBV從而獲益[4]。HBV基因整合一方面有利于其生存,另一方面可致宿主基因組某些位點突變,部分突變與乙肝慢性化有關,亦與PHC的發生發展相關。

2 HBV DNA整合與肝細胞癌變的關系

HBV感染是PHC的重要危險因素之一，文獻報道，80%以上的肝癌組織中可檢測到HBV DNA整合[13,14]。肝癌發生可能是HBV整合的結果[15],HBV整合可致肝細胞凋亡和抗癌基因信號通路異常[4]。研究[12]發現，應用逆轉錄PCR、Alu PCR和限制性核酸酶切位點PCR技術,HBV感染者甚至急性自限性乙肝患者HBV DNA能插入到機體基因組中。在85%～90%與HBV感染相關性PHC患者中能檢測到整合的HBV DNA[9]。

據報道大部分整合發生在常見的基因脆弱部位附近或其中,如易于被刪除、斷裂、重排和擴增的基因[4],控制基因增殖、細胞信號級聯轉導的序列變異或不穩定Alu序列和微衛星序列變化可致癌基因的發生發展。整合到基因組中編碼區或基因調節區的HBV DNA可改變宿主基因的表達或改變該基因所表達蛋白質結構和功能,這有可能導致惡變[9]。整合的HBV DNA表達合成成熟的preS/S和X蛋白觸發級聯信號轉導亦可使肝細胞發生惡變[9]。HBV基因組的增強子原件能按照一定方向或與位置無關的方式激活異源性啟動子,HBV基因增強子能反式激活距離整合處100 kb的宿主細胞基因[4]。

PHC患者HBV DNA整合靶基因區在早期研究中未明確，最近10年才有部分研究關注在PHC中HBV DNA整合位點和插入性突變。Paterlini-Bréchot等[5]采用HBV-Alu PCR技術從肝細胞癌患者標本中分離出9個HBV DNA整合區,這表明病毒導致的突變與PHC有關。位于HBV DNA整合區不同的基因具有特定關鍵性功能,這些功能與細胞信號級聯轉導或許有關。另外他們發現HBV DNA整合的靶基因：hTERT和IP3R基因在2例患者腫瘤組織中均出現,尤其人端粒酶逆轉錄酶基因[5]。Kimbi等[16]擴增5例急性乙肝患者和1例爆發性肝炎患者血HBV DNA和宿主基因組相應染色體DNA。在1例急性乙肝患者中,HBV DNA整合到宿主染色體7q11.23的位置,這是威廉姆斯-博伊倫綜合征關鍵區域1基因所在位置,這個基因包含大量Alu重復序列、重復原件,這些位點是HBV DNA容易插入和重組的位點，且整合子在威廉姆斯-博伊倫綜合征患者通常被刪除基因序列的區域內,引起雜合性缺失。該研究組亦提到整合子克隆擴增與腫瘤形成有關,而早期HBV DNA整合可能誘發肝癌發生。

3 HBV DNA整合與慢性乙肝的關系

Murakami 等[6]以Alu-PCR法分別檢測了19例急性乙肝患者、12例HBV相關慢性活動性肝炎患者、19例急性乙肝患者中3例肝臟標本中發現HBV DNA整合、全部12例HBV相關慢性活動性肝炎患者肝臟標本中均發現存在病毒整合，表明慢性乙肝HBV DNA整合率顯著高于急性乙肝，推測乙肝慢性化與HBV DNA整合有關。Shi等[17]報道HBV DNA特定位點整合可致T細胞缺陷，而乙肝慢性化與T細胞缺陷有關。

Minami等[18]研究慢性HBV感染HBV DNA在肝細胞的整合,在6例患者肝臟組織中他們檢測到42個獨立的HBV DNA和肝細胞基因的結合部位,其中20個完成染色體定位。表明HBV DNA與宿主基因的每個整合,受到宿主6個基因克隆體中1個的影響。在這6個基因中,AXIN 1 (Axis)是抑制肝癌的基因;EYA3 、bobby sox和odd Oz 2基因對于器官的生長發育有重要作用,但他們的功能尚未明確。該研究提示HBV DNA優先整合到3號染色體。混合系白血病(MLL)2和4基因亦被認為是HBV DNA優先整合的靶基因[19,20]。MLL4基因位于19號染色體19q13.1,該處基因在實體瘤中研究顯示存在擴增和重排。整合后特定位點表達的HBV X (HBx)或MLL4轉錄初級產物和蛋白與肝癌的發生有關[20]。乙肝慢性化與HBV DNA整合及優先的選擇性整合可能存在關聯。

早期，人們主要應用印記雜交、克隆測序和各種PCR的方法[20]來確定HBV整合。如今已開發應用新一代高通量測序(NGS)技術來鑒定HBV DNA特定的整合位點[21]。NGS亦稱深度測序,與第一代Sanger測序法相比，NGS 技術具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優點。NGS技術已大規模用于轉錄組測序、染色體免疫共沉淀測序、基因組甲基化測序、宏基因組測序、基因組從頭測序和全基因組的重新測序等方面。目前，主要的高通量測序平臺較多，以Hiseq和Miseq應用最為廣泛。

考慮到全基因組測序費用過高,Ding等[22]開發了另外一種可選的方法,用于鑒定HBV DNA整合位點,這一價廉而有效的方法稱為MAPS法[22]。通過這種方法,除了兩個熟悉的FN1和TERT1靶基因,他們還鑒定出2個新的HBV DNA整合位點基因,即肌動蛋白調節4和SMAD5基因。他們發現HBV DNA優先選擇17號染色體,且更多地整合到人基因轉錄位點。

4 HBV DNA整合與OHBI的關系

OHBI可檢測到HBV DNA,但血清中HBsAg等檢測不到。HBV DNA整合與OHBI關系尚不清楚，Bhargava等[23]研究發現，OHBI可致外周血淋巴細胞損害,OHBI與氧化應激有關。Pollicino等[24]報道了1例43歲PLC患者血清HBV和HCV檢測陰性,但HBV-Alu PCR顯示存在HBV DNA整合體,這個整合體位于PARD6G 基因上游,該基因在肝腫瘤組織中過表達。這兩項研究表明OHBI導致基因表達異常可能與癌基因致癌途徑有關。

HBV DNA有效整合到宿主基因組可增加OHBI幾率，同時亦增加了癌變機會。最常見的HBV整合位點發生在MLL和hTERT基因,另外,60S核糖體蛋白基因、血小板衍生的生長因子受體基因和鈣信號相關基因突變亦可能與癌變有關[3]。

綜上所述，我們可通過PCR、基因測序、基因克隆、芯片和免疫組化等方法來研究HBV DNA對宿主基因組的影響,主要包括與乙肝慢性化和PHC發生發展有關的研究。初步的研究表明乙肝慢性化與HBV DNA整合及優先的選擇性整合可能有關，但有待進一步研究證實。由HBV DNA整合引起的宿主基因突變鑒定及如何致PHC成為最近該領域的研究熱點。機體癌基因產生和激活是多因素共同作用的結果，其中HBV DNA整合到宿主基因組是直接機制之一,其他還可通過其結構蛋白、分泌蛋白,或通過表觀遺傳致宿主基因突變,部分突變與PHC的發生發展有關。但這些因素致癌機制及各因素之間的關系有待進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(81560102)。

徐光華(E-mail:wdianlei@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.037

R512.6；R735.7

A

1002-266X(2017)25-0107-03

2017-02-15)