可用于血清游離銅快速檢測的特異性識別元件

熊亞敏，黃沛力

首都醫科大學公共衛生學院，北京 100069

銅是生命體必需的微量元素之一，廣泛分布于生物組織中，其可作為輔酶因子參與生命活動，也可以參與紅細胞的形成，同時內環境中銅離子的穩定亦是維持機體健康的前提。隨著銅在制造業、化工及藥物合成等領域的廣泛應用，人們通過環境暴露、職業暴露以及醫源性暴露等接觸銅的機會越來越多，生物體攝入過量的銅后產生的大量自由基，可對造成機體氧化損傷[1-2]。美國環境保護署(EPA)中規定飲用水中Cu2+的限值為1.3 mg·L-1，我國《生活飲用水衛生標準》(GB5749—2006)中規定飲用水中Cu2+的限值為1.0 mg·L-1。銅進入血液后先與白蛋白松散結合，90%～98%的銅被運送至肝臟內與2球蛋白牢固結合形成銅藍蛋白，再釋放到血液中。根據結合銅原子數的不同，銅藍蛋白可分為飽和銅藍蛋白和不飽和銅藍蛋白。在機體中銅藍蛋白合成障礙時會導致血液中游離銅含量增加，這些過多的游離銅在肝、腎、腦等器官沉積，從而造成器官功能障礙[3]。

同時研究發現，血清游離銅(包括血清中的自由銅離子以及與白蛋白、氨基酸松散結合的銅離子)過量與肝豆狀核變性(Wilson disease，WD)、阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)等疾病有關[4-8]。以血清游離銅作為銅代謝障礙相關疾病臨床診斷生物標志物及治療過程評價指標的研究受到了廣泛關注[9-10]。臨床上，血清游離銅含量一般通過計算血清總銅與銅藍蛋白結合銅的差值得到，計算公式為：游離銅=血清總銅(mg·L-1)-0.3×銅藍蛋白(mg·L-1)/100，或游離銅=血清總銅(mol·L-1) -0.049×銅藍蛋白(mg·L-1)[11-12]。然而該計算方式在超過20%的病人中得到陰性結果，可能的原因在于采用免疫沉淀法測得的銅藍蛋白包括不飽和銅藍蛋白，使銅藍蛋白結合銅部分結果偏高[13]。另外，血清游離銅還可通過采用EDTA等螯合劑將游離銅從白蛋白等蛋白質上剝離，經超濾后通過電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)等方法進行測定[14-16]，這些檢測方法雖然結果準確，靈敏度高，但所需儀器昂貴，操作難度大，樣品前處理復雜，且對操作人員要求高，在基層醫院難以普及。因此，發展快速、靈敏、簡便的高選擇性血清游離銅檢測方法具有重要的臨床意義。目前的研究表明，基于銅離子特異性識別元件構建的熒光或電化學檢測方法的出現，使得游離銅的快速靈敏檢測成為可能。由于構建快速檢測銅離子方法的關鍵在于如何選擇和設計能對銅離子特異性響應的識別元件，因此本文對常用的銅離子特異性識別元件進行了歸類與概述。

1 有機小分子(Organic small molecules)

有機小分子對Cu2+的識別主要是依賴于Cu2+與芳香族化合物形成螯合物后發生的熒光淬滅現象。Kim等[17]利用水溶性有機化合物4,5-二羥基-1,3-苯二磺酸在Cu2+存在時的熒光淬滅性質，實現了Cu2+的特異性檢測，檢測范圍為0.03～0.64 mg·L-1，其對河水中Cu2+的檢測結果與AAS和ICP-MS的檢測結果一致。Mayr等[18]將識別及信號分子熒光黃染料固定在植入親水性聚合物中的纖維素顆粒上，用于飲用水及廢水中Cu2+的檢測，檢測范圍為0.00063～6.3 mg·mL-1，響應時間隨Cu2+濃度的不同而變化，廢水中共存的Fe3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Ca2+等對檢測的干擾可忽略。研究表明N-aryl-3-aminopropionic acids[19]系列水溶性化合物也可用于天然水和工業廢水中Cu2+的檢測，檢測范圍為0.005～3.0 mg·mL-1，其中N,N-di(2-carboxyethyl)aniline可用于嬰幼兒奶粉中1～12 mg·kg-1Cu2+的檢測[20]。

由于復雜樣品中可能有多種可引起熒光淬滅的成分，基于有機小分子熒光淬滅的“turn-off”檢測方式在生物樣品和細胞內檢測Cu2+產生假陽性信號的概率較高，因此基于有機小分子熒光增強的“turn-on”檢測模式受到了科研工作者的廣泛青睞。Yu等[21]合成了能特異性識別Cu2+并產生“turn-on”熒光信號的有機小分子羅丹明B酰肼類衍生物(Rhodamine B hydrazide derivative)，在Cu2+存在下該化合物所產生的熒光信號增強，除Hg2+外，過量的其他金屬離子對信號干擾極小，被應用于Hela細胞中Cu2+的雙光子成像。此外，Cu+也可選擇性地去除熒光屏蔽基團，Taki等[22]研究發現，Cu+可使MeO-fluorescein和TokyoGreem衍生物的C-O斷裂并氧化產生熒光，盡管Cu2+無此效應，但Cu2+可被GSH快速還原為Cu+，從而被探針識別并產生熒光，具有細胞滲透性的TokyoGreem衍生物也被用于Hela細胞中Cu2+成像。盡管以上有機小分子熒光探針能夠應用于Cu2+的選擇性檢測，但均存在不可逆的缺陷，不適用于檢測Cu2+水平隨時間的變動，Yang等[23]首次報道了一種可逆性Cu+熒光探針，硫冠醚修飾的三芳基吡唑啉熒光探針可選擇性結合Cu+并通過光致電子轉移產生熒光增強信號，被用于可視化監測NIH3T3細胞對銅離子吸收和排放的動力學變化。

Cu2+可在堿性溶液中催化魯米諾(luminol)、光澤精(lucigenin)、洛粉堿(lophine)與過氧化氫(H2O2)反應產生化學發光，化學發光強度與Cu2+濃度有關[24-25]。Lind等[26]將熒光素-NH2OH-化學發光體系用于血清中Cu2+的檢測，線性范圍為0.001～0.02 mg·L-1，除Fe2+和Fe3+外，其他金屬離子對檢測干擾較小。1,10-菲羅啉、巰甲丙脯氨酸與H2O2系統也可在堿性條件下被Cu2+識別并催化產生化學發光[27-28]。盡管這些有機小分子作為Cu2+的特異性識別元件，其設計簡單靈活，構建Cu2+檢測傳感器時無需額外加入信號分子，檢測方法快速簡便。但是它們通常合成條件苛刻，且Cu2+對這些有機熒光分子和化學發光底物的識別特異性稍差，其測定易受到其他過渡金屬離子的干擾，所以，在檢測前需要通過沉淀、吸附、加入掩蔽劑等方式去除或屏蔽干擾離子，增加了檢測的復雜性，因此難以用于成分不明確復雜樣品中Cu2+的檢測。

2 納米材料(Nanomaterials)

納米材料由于量子效應使其具有不同于大尺寸材料的獨特性質，如卓越的光、電、磁及催化活性等，其作為信號分子或識別分子已被成功用于DNA、蛋白質和小分子檢測領域。其在Cu2+檢測方面的應用亦受到了廣泛關注，如納米金、量子點等[29-31]。

納米金(AuNPs)具有尺寸依賴的光學性質，在可見光區域有強烈的表面拉曼吸收，制備簡單，穩定性好，并具有良好的生物相容性。Liu等[32]合成十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)穩定的AuNPs，在S2O32-存在下反應生成Au(S2O32-)23-絡合物，使部分AuNPs被溶解，AuNPs表面的等離子體共振(SPR)吸收降低，由于Cu2+可催化這一反應過程，且SPR吸收強度與Cu2+濃度負相關，Liu等將這一基于Cu2+對AuNPs蝕刻的傳感器用于自來水以及消解后的哈喇樣品中Cu2+的檢測，其結果與ICP-MS檢測結果相一致。

量子點(QDs)因具備可協調發射光譜、高熒光量子產率和光穩定性等優越性能已被用于對Cu2+的檢測[33-35]。Nurerk等[36]分別以巰基乙酸(TGA)、3-巰基丙酸(MPA)和谷胱甘肽(GSH)為穩定劑合成CdTe QDs用于水溶液中Cu2+的檢測，并對比了不同穩定劑對檢測靈敏度和特異性的影響，發現TGA和MPA修飾的QDs在檢測時會受到Ag+的干擾，GSH修飾的QDs對Cu2+的選擇性最高，檢測限為0.06 μg·L-1。基于QDs表面陽離子交換的Cu2+檢測方法大多易受到Hg2+和Ag+的干擾，主要是由于三者均可取代QDs表面的Cd2+導致熒光淬滅。Jin等[37]在檢測體系中加入硫代硫酸鹽在QDs表面形成鈍化層，加入金屬離子后，Cu2+仍可取代Cd2+，而Hg2+和Ag+被鈍化層阻擋，顯著改善Cu2+檢測的靈敏度和選擇性，檢測限低至0.14 nmol·L-1。

Cu2+與石墨烯量子點(GQDs)表面的羧基結合，產生能量轉移導致GQDs的熒光淬滅，響應區間為0.1～10mol·L-1[38]。根據熒光共振能量轉移機理，GQDs表面的羧基個數對檢測靈敏度有較大影響，Li等[39]采用K2S2O8對合成的GQDs進行后氧化處理，增加GQDs的氧化程度并將其用于水中Cu2+的檢測，檢測范圍為0～20mol·L-1。Baruah等[40]利用氧化石墨烯量子點(GOQDs)作為交聯劑誘導聚乙二醇(PVA)形成嵌合有GOQDs的水凝膠，Fe2+、Co2+和Cu2+可與GOQDs表面的-NHR基團形成金屬離子復合物，并從水凝膠中釋放到溶液中使溶液呈現相應的顏色，該過程可通過UV-vis光譜檢測，Cu2+檢測限為10-7mol·L-1。

相比于強度型探針容易受環境條件、儀器效率、探針濃度等因素的影響，比率型熒光探針則可通過2個或多個發射波段的自校準消除探針濃度與環境因素等改變對測量體系的擾動[41-42]。Zhu等[43]構建雙發射比率型熒光探針選擇性檢測細胞內Cu2+，包覆在硅殼內的CdSe (em=644 nm)僅作為參考信號消除背景信號的干擾而對Cu2+無響應，N-(2-aminoethyl)-N,N,N’tris(pyridin-2ylmethyl)ethane- 1,2-diamine (AE-TPEA)功能化的碳量子點(CQDs) (em=485 nm)與CdSe雜交形成殼核型雙發射QDs，Cu2+淬滅CQDs的藍色熒光而不影響CdSe的紅色熒光，因此I485/I644隨著Cu2+濃度產生連續變化，檢測范圍為5×10-6～2×10-4mol·L-1。Yao等[44]通過EDC/NHS偶聯2種不同發射波長的CdTe QDs形成雙發射熒光探針，直接利用Cu2+淬滅QDs熒光的特性，實現了水中Cu2+的可視化檢測，隨著Cu2+的加入，探針由綠色連續變為紅色，檢測限為1.1 nmol·L-1。Liu等[45]將羅丹明B (em=585 nm)封裝于硅納米顆粒內，并在其表面修飾CQDs (em=467 nm)，在0～3×10-6mol·L-1范圍內I467/I585與Cu2+濃度呈負相關，檢測限35.2 nmol·L-1，成功應用于MCF-7細胞中Cu2+的成像。上述幾種比率型熒光探針均是將參比信標封裝于納米硅顆粒內，極大地降低了QDs的熒光強度，Zou等[46]通過EDC/NHS法在硅納米顆粒表面共價修飾特異性識別Cu2+并產生熒光淬滅的CdTe/CdS QDs (紅光)，并在CdTe/CdS QDs表面共價修飾對Cu2+不敏感的藍光碳點(CDs)作為參比信號，構建了比率型熒光納米探針，并對Hela細胞中的Cu2+進行了成像分析。

納米材料既可作為Cu2+特異性識別元件，亦是檢測的信號分子，以其為識別元件構建的Cu2+檢測方法具有靈敏度高、信號穩定等優勢，可實現樣品中痕量Cu2+的高靈敏檢測。然而納米材料的生物相容性較差，在生物樣本中易發生團聚或降解，造成靈敏度下降，限制了其在生物樣品檢測中的應用。

3 生物分子(Biomolecules)

3.1 肽鏈

傳統熒光化學傳感器的識別元件多為有機物構成的螯合劑，其合成條件嚴格且與Cu2+的結合多為不可逆。而金屬結合蛋白中的肽基序能夠保持其金屬離子選擇性，且肽鏈合成簡單，成本低，其作為特異性識別生物分子已在很多金屬離子檢測傳感器的設計中得到應用[47-48]。研究發現，氨基酸殘基中的Gly-Gly-His序列是Cu2+的結合位點，其選擇性可通過改變肽鏈的骨干結構得以實現。Zheng等[49]設計的Gly-Gly-His-Gly序列可以與Cu2+1:1結合，結合常數為3.8×106；Kerim等[50]用Gly-His-Leu-Leu-Cys肽鏈修飾CdS QDs設計了對Cu2+和Ag+具有雙重響應的熒光探針。Brianna等[51]以甘氨酸和天冬氨酸合成肽鏈(Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly)做為識別分子并利用熒光共振能量轉移原理構建熒光探針，在pH 7.0的條件下，該探針對Cu2+表現出高靈敏度和選擇性，檢測限為32g·L-1。Bishnu等[52]設計了骨架為Cys-X-Gly-His-X-Gly- Glu的金屬離子識別分子，并發現當X為Gly時，該肽鏈表現出對Cu2+的特異性識別，當X為Pro時，可特異性識別Zn2+，結合常數分別為4.9×1012和6.8×106。

金屬和金屬配合物可催化短肽中的肽鍵水解，多肽和蛋白質在金屬離子作用下的選擇性切割在分子生物學和生物化學中具有重要意義。Cu2+能夠特異性識別多肽中的“NDKTHC”序列，并切割Lys和Thr形成的肽鍵，切割效率與Cu2+濃度有關。呂曉利等[53]設計“Ser-Asp-Lys-Ser-His-Thr-Lys”多肽鏈識別Cu2+，肽鏈兩端分別標記熒光基團和淬滅基團，Cu2+存在下切割肽鏈斷裂，熒光基團遠離淬滅基團，熒光恢復，該設計可大大降低背景熒光，提高探針檢測靈敏度，其在水中的檢測限為10 nmol·L-1。

以肽鏈為識別元件的Cu2+檢測方法具有肽鏈合成簡單、成本低、生物相容性好等優點，但在進行生物樣品檢測時，肽鏈易受到樣本中酶的作用而發生水解。肽鏈的防酶切保護是將其應用于生物樣品中特異性識別Cu2+所面臨的最大挑戰。

3.2 功能化核酸

功能化的脫氧核糖核酸(DNA)包括DNA酶(DNAzyme)和核酸適配體(Aptamer)已在細胞和生物大分子檢測中得到了廣泛的應用。Cu2+依賴的DNAzyme (Cu-DNAzyme)和Cu2+核酸適配體是通過指數富集的配體系統進化技術(SELEX)篩選得到的，對Cu2+具有特異性識別功能的DNA片段。

Cu-DNAzyme是由Carmi等[54-56]篩選得到的，由2條DNA鏈組成：具有酶活性的序列和與之互補的底物序列，在沒有Cu2+時，Cu-DNAzyme不具有催化活性，2條DNA鏈通過堿基互補配對形成穩定的雙螺旋結構，當Cu2+存在時，Cu-DNAzyme催化切割底物鏈，雙螺旋結構降解并釋放出切割后產生的底物鏈碎片。通過在底物鏈上修飾信號分子，可構建比色、熒光、化學發光或電化學傳感器檢測Cu2+。Liu等[57]在2007年首次使用Cu-DNAzyme構建“turn-on”熒光生物傳感器，在幾分鐘內實現對水中Cu2+的高選擇性靈敏檢測，檢測限35 nmol·L-1。隨后，一些以Cu-DNAzyme為特異性識別分子的Cu2+檢測方法得到建立。Lu等[58]以AuNPs為載體，同時修飾Cu-DNAzyme和Zn-DNAzyme，并分別在底物上標記不同發射波長的熒光染料及對應的淬滅劑，實現了活細胞內Cu2+和Zn2+的成像及原位同時檢測。Yin等[59]采用一段具有HRP活性的DNA酶(HRP-DNAzyme)序列將Cu-DNAzyme與底物序列連接，其在Cu2+存在下，底物序列被切割釋放后，HRP-DNAzyme序列形成G-四聚體結構，捕獲Hemin而產生HRP催化活性，催化TMB底物顯色，該方法在飲用水中的檢測限為1 μmol·L-1。

具有獨特光學性質的AuNPs常與Cu-DNAzyme相結合設計免標記可視化的Cu2+檢測方法[60-62]，其原理為底物鏈被Cu-DNAzyme催化切斷后會誘導AuNPs聚集從而引起檢測體系顏色的變化。同時相關的研究表明，通過在電極上結合Cu-DNAzyme及其底物鏈，當Cu2+存在時，Cu-DNAzyme可切割底物鏈，對電化學信號產生循環放大，從而實現對Cu2+的高靈敏檢測[63-64]。另外，隨著UO22+，Pb2+等金屬離子依賴的DNAzyme的發現，基于DNAzyme的金屬離子檢測微陣列被開發并應用于多種金屬離子的快速同時檢測[65]，其高靈敏度、高選擇性和高通量的特點使其在環境檢測、食品安全檢測、臨床診斷等方面具有很大的應用潛能。

Cu2+核酸適配體是由Qu等[66]在2016年篩選得到的，目前未見有文獻報道基于Cu2+核酸適配體作為識別分子所建立的Cu2+檢測方法，但作為被稱為“化學抗體”的核酸適配體，其在Cu2+選擇性檢測方面必將具有廣闊的應用前景。

3.3 抗體

功能化核酸合成簡單、化學穩定性好、特異性高、生物相容性好。然而，將其應用于生物樣本的檢測仍然存在著易被酶解的不足。免疫檢測是利用抗體與抗原的特異性結合對待測物質進行分析，抗體對相應抗原的識別具有高度特異性，且其作為完整蛋白在生物樣本中的穩定性較好。免疫檢測技術以其高特異性、低成本和實時快捷等優勢已在生物毒素、腫瘤標志物和微生物檢測等領域得到廣泛應用。1985年Reardan等[67]首次分離出In3+的特異性抗體，從此開啟了重金屬免疫檢測技術研究的先河。

Cu2+免疫檢測的關鍵在于特異性Cu2+單克隆抗體的制備，特異性單克隆抗體制備的關鍵又在于重金屬免疫原。Cu2+為小分子物質，在生物體內不會引起免疫反應，因此應先制備具有免疫活性的免疫原。制備Cu2+免疫原通常利用雙功能螯合劑(常為EDTA或DTPA的衍生物)與Cu2+形成Cu-螯合劑復合物，螯合物為低分子量不具有免疫活性的半抗原，需將其與載體蛋白偶聯，形成完整的免疫原，常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。在成功制備重金屬抗原之后，可以通過小鼠免疫、細胞融和、雜交瘤篩選、抗體純化等步驟制備Cu2+特異性單克隆抗體。

目前，重金屬離子的免疫檢測都是采用抗原抑制檢測的方法，可分為熒光偏振免疫檢測、間接競爭ELISA免疫檢測、一步法免疫檢測(直接競爭ELISA法)、KinExA免疫檢測和免疫膠體金快速檢測方法。Liu等[68]利用p-SCN-Bn-DOPA為雙功能螯合劑，KLH為載體蛋白合成Cu2+免疫原，免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細胞篩選獲得對Cu-EDTA具有高親和力和特異性識別的單克隆抗體，并建立間接競爭ELISA法對飲用水中Cu2+和血清中游離銅含量進行檢測，檢測限為0.032g·mL-1，除與Hg2+的交叉反應率為7.9外，與Cd2+，Cr3+，Fe3+，Mn2+，Ca2+等其它常見金屬離子的交叉反應率均小于1%，其準確度與精密度與原子吸收檢測結果相比無明顯差別。Kong等[69]用Cu-p-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫BALB/c 雌性小鼠制備Cu2+單克隆抗體，并對水中Cu2+進行檢測，檢測限為0.003 mg·L-1，與其他金屬離子交叉反應率小于1%。王玉珍等[70]利用ITCBE為雙功能螯合劑，BSA為載體蛋白，免疫小鼠制備Cu2+單克隆抗體，并建立間接競爭ELISA檢測Cu2+，檢測限為2.15 ng·mL-1，與Cd2+、Zn2+、Hg2+、Cr3+、Pb2+等金屬離子與EDTA螯合物的交叉反應率小于0.1%。

Ouyang等[71]在間接競爭化學發光(CLIA)免疫檢測Cu2+的基礎上，利用Cu-EDTA自身具有的催化Luminol-H2O2化學發光的性質，建立了一種免標記增強化學發光免疫檢測Cu2+的方法。與傳統的CLIA相比，免標記CLIA檢測限更低(0.33 ng·mL-1)、線性范圍更寬(1.0～1 000 ng·mL-1)；另外，免標記CLIA的特異性來自于Cu2+單克隆抗體和Cu-EDTA催化Luminol-H2O2化學發光體系的雙重特異性，避免了常見金屬離子的干擾。免疫層析膠體金試紙條檢測法是通過固相載體硝酸纖維膜、玻璃纖維膜等層析材料的毛細擴散作用，使樣品溶液沿一定方向泳動，同時使固定于其上的膠體金標記的待測物受體或待測物與待測樣品中抗原或抗體發生高親和力的特異性免疫反應，并在檢測區上富集，得到肉眼可判的顯色結果。唐佳佳[72]和劉文迪[73]分別利用銅單克隆抗體制備Cu2+檢測膠體金試紙條，肉眼檢測限分別為200 ng·mL-1和75 ng·mL-1，在4 ℃避光保存下60 d，試紙條依然有效。

抗體作為Cu2+的識別元件具有高特異性和高親和力的優勢，但其制備過程耗時長、成本高。目前以免疫檢測為核心的Cu2+檢測技術尚處于起步階段，仍然存在著不少的問題，主要表現在：商品化Cu2+單克隆抗體較少，且無統一評價標準，研究者多使用自制抗體，效價參差不齊，使各項工作的橫向評價比較困難。

4 展望(Prospect)

綜上所述，目前Cu2+檢測所用的特異性識別元件可分為有機小分子、納米材料和生物分子。有機小分子一般在做為識別元件的同時也是信號分子，其設計靈活，可通過不同功能基團的修飾改變其選擇性；納米材料可通過表面功能化修飾實現對Cu2+的高靈敏、特異性響應；生物分子作為Cu2+識別分子則具有良好的生物相容性，其中肽鏈和功能化核酸具備合成簡單、成本低、易修飾等優點，而Cu2+單克隆抗體則具備對Cu2+的高特異性識別性能。因此基于上述特異性識別元件構建的Cu2+檢測方法已被廣泛應用于環境及食品中Cu2+的檢測，但由于血清中游離銅含量較低、存在形式復雜、血清中干擾成分多等原因，其應用于血清游離銅檢測的方法鮮有報道。盡管如此，或許我們可以通過對上述特異性識別元件進行修飾和改進，實現生物樣品中游離銅的快速檢測，其中如何進一步提高銅離子識別元件對游離銅的親和力、特異性以及在生物樣品中的穩定性和抗干擾能力是構建低成本、高靈敏、高特異性的血清游離銅快速檢測方法的關鍵所在。

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