高效液相色譜法測定柴胡配方顆粒中柴胡皂苷a含量

繆希紅，李曉燕，高君文，蘇平菊

（1．河北省承德市中心醫院，河北 承德 067000； 2．河北以嶺醫藥研究院，河北 石家莊 050035）

·檢驗檢測·

高效液相色譜法測定柴胡配方顆粒中柴胡皂苷a含量

繆希紅1，李曉燕2，高君文2，蘇平菊2

（1．河北省承德市中心醫院，河北 承德 067000； 2．河北以嶺醫藥研究院，河北 石家莊 050035）

目的建立測定柴胡配方顆粒中柴胡皂苷a含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法色譜柱采用Welch Ultimate XB-C18柱（250mm× 4．6mm，5 m），以乙腈-甲醇-0．1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為210 nm。結果柴胡皂苷a進樣量在0．660 4～6．604 0 g范圍內與峰面積線性關系良好，回歸方程為 Y＝288．216X-6．057，r＝0．999 97，柴胡皂苷a的平均回收率為101．99%，RSD為1．91%（n＝9）。結論該方法簡便、準確，重復性好，可用于柴胡配方顆粒的質量控制。

高效液相色譜法；柴胡配方顆粒；柴胡皂苷a

柴胡配方顆粒是由中藥材柴胡經提取、濃縮、分離、干燥、制粒及包裝等加工工藝制成的顆粒劑，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效[1]，用于和解退熱、疏肝解郁、升舉陽氣、升散除濕等[2]。服用方便，劑量準確，高效迅速，質量穩定，近年來，其銷量逐年上升，深得消費者青睞[3]。柴胡配方顆粒中的主要藥味柴胡為歷版《中國藥典》收載藥材，應用廣泛，其主要化學成分為三萜皂苷類成分，包括柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b3、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d等[4-5]，均有很強的藥理活性，其中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量較高，是柴胡重要的質量評價指標[6-8]。為了更好地控制柴胡配方顆粒的質量，本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法對柴胡皂苷a進行了含量測定，現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀，包括VWD紫外檢測器（美國安捷倫公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AT201型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1．2 試藥

柴胡皂苷a對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110777-200406）；柴胡配方顆粒（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號為150101）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：WelchUltimateXB-C18柱(250mm×4．6mm，5μm)；流動相：乙腈為流動相 A，甲醇為流動相 B，0．1%磷酸溶液為流動相C，梯度洗脫，見表1；流速：1 mL／min；柱溫：26℃；檢測波長：210 nm。理論板數按柴胡皂苷a峰計算應不低于5 000。

表1 流動相梯度洗脫程序

2．2 溶液制備

對照品溶液：取柴胡皂苷a對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含柴胡皂苷a0．2mg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品，研細，取1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25m L，密塞，稱定質量，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）20min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：因本制劑為單味藥材且制劑時未添加輔料，取制備供試品溶液用的甲醇。

2．3 方法學考察

陰性干擾試驗：取2．2項下3種溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相應位置上有相同保留時間色譜峰，陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：精密吸取質量濃度為 0．066 04，0．132 08，0．198 12，0．330 2，0．660 4 g／L的柴胡皂苷a對照品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值(Y)為縱坐標、進樣量(X)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝288．216X-6．057，r＝0．999 97。結果表明，柴胡皂苷a進樣量在0．660 4～6．604 0μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10μL，在擬訂色譜條件下連續進樣5次，測定峰面積。結果對照品的平均峰面積為569．391，RSD為0．69%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取供試品溶液 10μL，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h時進樣，測定峰面積。結果的 RSD為1．82%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品9份，分別取高、中、低3個劑量，依法制備供試品溶液，測定含量。結果見表2。

表2 柴胡皂苷a重復性試驗結果（n＝9）

加樣回收試驗：取同一批樣品9份，分為3組，分別精密加入25m L高、中、低3種質量不同濃度的柴胡皂苷a對照品溶液，進行超聲提取，測定含量，計算回收率。結果見表3。

表3 柴胡皂苷a加樣回收試驗結果（n＝9）

耐用性試驗：取同一批樣品，分別在不同測定波長、不同柱溫及不同色譜條件下檢測柴胡皂苷a的含量。結果在210，208，212 nm波長下，柴胡皂苷 a的 RSD為1．70%(n＝3)；在24，26，28，30℃柱溫下，柴胡皂苷a的 RSD為1．54%(n＝4)；3種不同色譜柱對樣品的分離無影響，柴胡皂苷a的 RSD為1．68%(n＝3)。可見，測定條件的微小變動對檢測結果無影響。

2．4 樣品含量測定

用所建立的含量測定方法，測定3批柴胡配方顆粒柴胡皂苷a的含量，結果批號為150101，150102，150103的3批樣品中柴胡皂苷a的含量分別為4．6641，3．7038，3．708 8mg／g。

3 討論

3．1 色譜條件選擇

柴胡中的主要成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在紫外區僅有末端吸收，該區域成分較多，不易進行定量測定，檢測時易受到試劑的干擾[9]。另外，皂苷類成分樣品處理較復雜，故對其定量測定不多。目前，柴胡制劑中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的測定方法主要為HPLC法，檢測器有ELSD檢測器和VWD紫外檢測器[10-14]，流動相為甲醇-乙腈-水 (25∶45∶30)、乙腈-水(28∶72)及乙腈-水進行梯度洗脫。本研究中曾采用2010年版《中國藥典（一部）》柴胡項下含量測定的流動相[1]，對乙腈-水進行梯度洗脫，但該流動相柴胡皂苷a分離不好，且峰形不對稱，經反復調整流動相比例，并在流動相中添加甲醇和磷酸，使柴胡皂苷a獲得良好分離，峰形對稱，基線平穩，梯度洗脫可縮短分析時間，降低檢測成本。

3．2 樣品處理篩選

柴胡皂苷測定的樣品處理方法有采用甲醇超聲提取，大孔吸附樹脂除雜[10]，采用5%濃氨試液的甲醇溶液提取后用正丁醇萃取的方法[11-13]，以及采用甲醇提取、正丁醇萃取、堿洗的處理方法[13]等，但處理過程煩瑣，操作復雜，不利于大批量生產的產品控制。本研究中采用甲醇超聲提取，取續濾液即可，方法簡單，易操作，特別適用于大批量生產的產品質量控制。

3．3 提取溶劑選擇

本研究曾對70%甲醇、甲醇及含5%濃氨試液的甲醇溶液提取的樣品進行柴胡皂苷a檢測，結果3種溶劑測定的柴胡皂苷a含量差異不明顯，色譜峰也無差異，為簡化操作，選擇用甲醇做提取溶劑；為保證柴胡皂苷a提取充分，對提取溶劑用量及超聲處理時間進行考察，結果提取溶劑選擇25m L與50m L時柴胡皂苷a含量無差異，超聲處理時間20～40 min對柴胡皂苷a含量影響不大。

3．4 不足

柴胡在煎煮過程中皂苷類成分存在結構性轉變[15-16]，柴胡配方顆粒中柴胡在提取過程中成分發生變化，導致柴胡皂苷d的含量過低，無法進行定量測定，因此本研究中僅對柴胡皂苷a進行了含量測定。

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Content Determ ination of Saikosaponin A in Chaihu Dispensing G ranules by HPLC

Miao Xihong1,Li Xiaoyan2,Gao Junwen2,Su Pingju2
(1．Chengde Central Hospital,Chengde,Hebei,China 067000; 2．Hebei Yiling Medicine Institute,Shijiazhuang,Hebei,China 050035)

Ob jective To establish an HPLC method for the content determination of saikosaponin a in Chaihu Dispensing Granules．M ethods HPLC analysis was performed on an Welch Ultimate XB-C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)with acetonitrilemethanol-0．1% phosphoric acid solution as mobile phase for gradient elution．The detection wavelength was at 210 nm．Results The calibration curve of saikosaponin a showed a good linearity within the range of 0．660 4-6．604 0μg,and the regression equation was Y＝288．216 X-6．057(r＝0．999 97)．The average recovery was 101．99% and RSD was 1．91%(n＝9)．Conclusion The method is convenient,accurate and reproducible to operate and is suitable for the quality control of Chaihu Dispensing Granules．

HPLC;Chaihu Dispensing Granules;saikosaponin a

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2017)03-0033-03

2016-06-22；

2016-10-20)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．011

繆希紅（1974-），女，滿族，副主任中醫師，研究方向為中醫臨床及制劑開發，（電子信箱）944359932＠qq．com。

李曉燕（1974-），女，滿族，正高級工程師，研究方向為中藥新藥開發及質量標準，（電話）0311-66703013（電子信箱）sjzyllxy＠163．com。