小細胞性肺癌患者檢測抗紡錘體抗體和抗著絲點抗體的臨床意義①

譚立明 張玉紅 陳娟娟 李 華 肖揚婧卿 吳 洋 曾婷婷 田永建 余建林

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，南昌330006)

小細胞性肺癌患者檢測抗紡錘體抗體和抗著絲點抗體的臨床意義①

譚立明 張玉紅②陳娟娟 李 華 肖揚婧卿②吳 洋 曾婷婷 田永建 余建林

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，南昌330006)

目的：研究抗紡錘體(MSA)和抗著絲點(ACA)抗體檢測對診斷小細胞性肺癌(SCLC)的臨床價值，為SCLC的分子研究提供臨床依據。方法：對93例SCLC患者和208例非小細胞性肺癌(NO-SCLC)患者及50例健康體檢者，用酶聯免疫法定量檢測MSA抗體，間接免疫熒光法定性檢測MSA、ACA和抗核抗體(ANA)，并對其結果進行回顧性分析。結果：①IIF法檢測SCLC組MSA和ACA陽性率為36.56%和30.11%，均高于其他腫瘤組(P<0.01)。②相關性分析，MSA與SCLC的RR值高達12.93、12.74，ACA和ANA與SCLC的RR值為4.31和3.48。③MSA檢測SCLC的ROC曲線下面積AUC為0.778，診斷價值中等。 結論：MSA和ACA對SCLC有很強正相關危險因素，可能參與SCLC的發生發展，對SCLC的早期檢測、臨床診斷及潛在的治療方法有一定的應用價值。

小細胞型肺癌；抗紡錘體抗體；抗著絲點抗體；抗核抗體

小細胞型肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)是我國乃至全球癌癥死亡的主要原因，占肺癌的10%～15%[1]。SCLC分化極差、侵襲性強、生長迅速，常發展到晚期才出現臨床表現，早診斷、早治療是關鍵。目前的診斷方法有病理學、影像學、血清學等檢測方法，對SCLC診斷率均不高、特異性不強[2]，SCLC有一特點——早期就發生血行轉移，理論上利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高[3]，通過腫瘤自身抗體檢測對提高SCLC的診斷率、生存率意義更大。筆者在臨床檢測中發現，在SCLC患者血清中MSA和ACA陽性率明顯高于其他腫瘤患者，現將研究結果分析報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 腫瘤患者均為2011年12月～2013年12月在南昌大學第二附屬醫院門診及住院確診病例，SCLC患者93例(男69例、女24例，30～82歲，平均62歲)，肺腺癌(Lung adenocarcinoma carcinoma，LAC)62例(男48例、女14例，42～77歲，平均64歲)，肺鱗癌(Lung squamous carcinoma，LSC)52例(男39例、女13例，40～81歲，平均65歲)，胃癌(Gastric cancer，GC)27例(男18例、女9例，45～71歲，平均56歲)，肝癌(Hepatocellular carcinoma，HC)29例(男20例、女9例，39～75歲，平均59歲)，大腸癌(Intestinal cancer，IC)22例(男14例、女8例，44～69歲，平均58歲)，鼻咽癌(Nasopharynx cancer，NC)16例(男11例、女5例，39～71歲，平均57歲)；健康對照50例均來自南昌大學第二附屬醫院體檢中心健康體檢者(男31例、女19例，27～65歲，平均55歲)。所有入選者自愿接受實驗并簽署知情同意書。

1.1.2 診斷依據 SCLC診斷標準參考美國NCCN小細胞肺癌臨床實踐指南[4]。

1.1.3 納入標準 符合所有條件者予以納入：①知情、自愿參與；②診斷明確，臨床、影像學、病理組織學資料完整；③對入選患者的資料重新評估，否定合并其他自身免疫性疾病及合并其他癌癥；④健康對照組者血常規、血壓、血糖、血脂、胸片、心電圖及肝膽胰檢查無異常。

1.1.4 排除標準 以下情況者予以剔除：①腫瘤分型不明確或非原發性腫瘤；②合并嚴重心、肺、肝、腎臟等系統疾病，甲狀腺疾病、糖尿??；③妊娠或哺乳期婦女；④不符合納入標準者。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 空腹采靜脈不抗凝血3.0 ml左右，2 500 r/min離心15 min分離血清，-20℃冷凍待檢，避免反復凍融。

1.2.2 間接免疫熒光法 檢測MSA、ACA和ANA抗體。試劑由德國歐蒙公司生產，MSA抗體采用歐蒙實驗室提供的全新Hep-20-10細胞株，ACA和ANA采用Hep-2細胞，4℃保存備用。標本按試劑要求稀釋，取25 μl于玻片上，覆上生物膜片，室溫孵育30 min，洗去游離標本，用洗液浸泡5 min，瀝干加20 μl異硫氰酸熒光素標記二抗，避光室溫孵育30 min，沖去游離二抗，用洗液浸泡5 min，瀝干后用甘油封片。熒光顯微鏡觀察結果。

1.2.3 ELISA法 檢測MSA抗體。試劑盒由美國R&D公司生產，操作步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行，在包被紡錘體抗原的聚丙乙烯孔中，樣本孔加入稀釋液40 μl、血清10 μl，標準孔加入不同稀釋濃度標準品50 μl，空白孔不加樣本和酶，37℃溫箱孵育30 min，洗液洗板5次，加辣根過氧化物酶(HRP)結合的紡錘體抗原50 μl，37℃溫箱孵育30 min，洗板5次，加底物和顯色劑顯色各50 μl，37℃溫箱孵育10 min，加終止液，用450nm波長比色，計算結果。

1.2.4 評價指標 根據經金標準確診的患者體內抗體檢測結果來計算自身抗體的臨床評價指標：敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、準確性和約登指數。

1.3 統計學分析 統計分析應用SPSS16.0軟件，計數資料以例數(百分比)描述。①組間單因素分析采用χ2檢驗。②MSA與SCLC相關性用相對危險度(Relative risk,RR)及RR的顯著性χ2確定，RR>1,正關聯危險因素；RR<1,保護因素。③抗體間優勢分析采用配對χ2檢驗，一致性分析計算Kappa值(P<0.01)。④對定量資料作受試者特征曲線(Receiver operating characteristic,ROC),計算ROC曲線下面積(Area under the curve,AUC)。

2 結果

2.1 MSA、ACA、ANA與SCLC相關性分析 SCLC患者血清MSA、ACA抗體檢測陽性率與其他癌癥患者比較，經χ2檢測，均P<0.01，差異有非常顯著統計學意義；相關性分析RR值顯示MSA為SCLC關聯很強的正相關危險因素，ACA、ANA為關聯強的正相關危險因素，結果見表1。

2.2 SCLC與其他腫瘤組檢測自身抗體結果(間接免疫熒光法) SCLC組MSA、ACA和ANA陽性率為36.56%、30.11%和24.73%，MSA和ACA與其他組比較差異均有統計學意義，χ2檢測，均P<0.01，結果見表2。

表1 兩種檢測方法對SCLC及其他癌癥患者血清MSA抗體檢測結果[n(%)]

Tab.1 MSA detection in patients with SCLC and other types of cancer by two methods[n(%)]

GroupsnELISAMSAMSAIIFACAANASCLC9339(41.94)34(36.56)28(30.11)23(24.73)NO-SCLC20811(5.29)9(4.33)7(3.37)19(9.13)RR12.9312.744.313.48χ262.3154.5311.3814.58P<0.01<0.01<0.01<0.01

Note：RR value:Highly strongly relative (≥10.0),strongly relative(3.0-9.0),intermediately relative (1.5-2.9).

表2 SCLC及其他癌癥患者自身抗體檢測結果[n(%)]

Tab.2 Results of autoantibodies in SCLC and other cancer groups[n(%)]

Note：vs SCLC,1)P<0.01;2)P<0.05.

表3 SCLC中各項臨床評價指標結果

Tab.3 Clinical evaluation parameters in SCLC

GroupSensib-ility(%)Specif-icity(%)Likelihoodratio(+)Likelihoodratio(-)Availab-ility(%)YoudenindexMSA36.5695.197.600.6777.080.32ACA30.1196.638.930.7276.080.27ANA24.7389.902.450.8469.770.15

表4 SCLC組抗體間優勢分析(P)和一致性分析Kappa (κ)

Tab.4 Advantage analysis(P) and consistency analysis [Kappa(κ)] between antibodies in SCLC group

GroupMSA&ACAMSA&ANAACA&ANAP0.3270.0520.383K(P<0.01)0.3740.3280.435

Note：Kappa(κ):0.4-0.6 as moderate consistency,0.6-0.8 as high consistency,>0.8 as great consistency.

2.3 SCLC患者MSA、ACA和ANA抗體檢測的各項臨床評價指標(免疫熒光法) MSA對檢測SCLC的準確性最高為77.6%，MSA和ACA特異性高達95.19%和96.63%，結果見表3。

2.4 SCLC患者MSA、ACA和ANA抗體間優勢分析(P)和一致性分析Kappa (κ)(免疫熒光法) 一致性分析顯示在SCLC中MSA與ACA、ANA一致性較差；優勢分析顯示三者對診斷SCLC均無明顯差異。見表4。

2.5 MSA對診斷SCLC準確性評估作ROC曲線 MSA的 AUC(P<0.01)為0.778，診斷價值中等。見圖1。

3 討論

SCLC 目前缺乏有效的早期診斷及治療方法，治療后復發率高，5年生存率僅為6.4%[2]。SCLC是來自肺神經內分泌細胞、惡性程度最高的一種肺癌，一些罕見的屬于自身免疫性疾病的神經系統副腫瘤綜合征與SCLC高度相關。研究表明，在一些沒有自身免疫性疾病的早期SCLC患者或在未來發展為SCLC患者體內可發現多種自身抗體[5,6]，雖然滴度不高，但這足以說明自身免疫反應影響著SCLC的發生發展，這些免疫反應可能是SCLC的一個窗口期反應，在機體發展為SCLC之前免疫系統就表現出癥狀，這提示可以通過檢測這些自身免疫性標志物(Marker)來為SCLC的早期診斷及預測提供途徑。如果在未發展為SCLC時就加以干涉，或早期發現SCLC并加以正確治療，將有希望增高SCLC的診斷率和生存率，并為改進SCLC的臨床治療方法提供方向。

導致肺癌的主要危險因素是吸煙、工作環境及遺傳，研究表明肺部有害物質的長期接觸可誘導細胞DNA損傷和破壞紡錘體，危險因素暴露的細胞停留在細胞分裂中期，在此過程中可產生兩個以上子細胞或發生細胞融合——非整倍體細胞生成，這與中心體數目異常有關[7，8]。中心體是微管的主要組織中心，它分裂分離成紡錘體的兩極，中心體數目受紡錘體功能的調控，細胞分裂中期，所有染色體的著絲點位于赤道面上，染色體分離就依靠附著于著絲點上的紡錘體微管完成[9]。研究發現在腫瘤細胞中紡錘體相關蛋白基因出現異?？杀憩F為紡錘體相關蛋白過度表達[10]，過度表達的相關蛋白在細胞內積聚，機體免疫耐受增高引起自身免疫反應，產生自身抗體，這似乎與本研究發現的結果有奇妙的聯系，IIF法檢測SCLC組MSA和ACA陽性率為36.56%和30.11%，均高于其他腫瘤組，經χ2檢測，均P<0.01，差異有非常顯著性統計學意義。這說明免疫系統針對紡錘體及著絲點為抗原所引發的免疫反應在一定程度上影響著SCLC的發生發展過程，此結論有理可據，筆者將實驗結果作相關性分析發現，兩法檢測MSA與SCLC的RR值分別高達12.93和12.74，ACA和ANA與SCLC的RR值為4.31和3.48，MSA為SCLC關聯很強的正相關危險因素，ACA、ANA為關聯強的正相關危險因素，對SCLC的早期診斷有臨床應用價值。

目前，關于腫瘤的自身免疫反應的研究尚不成熟，SCLC體內能檢測到多種自身抗體，但抗紡錘體抗體的研究未見報道，本研究選擇Hep-20-10細胞基質檢測MSA抗體，采用IIF法檢測發現，Hep-20-10細胞株具有多于Hep-2數十倍的分裂期細胞。與常規方法相比，利用HEp-20-10細胞更容易辨別分裂期細胞特異性結構(著絲點、紡錘體纖維、中間體、中心粒和核仁形成區)抗體。MSA對診斷SCLC的特異性為95.19%，準確性高達77.08%，陽性率為36.56%明顯高于其他腫瘤組，經χ2檢測，均P<0.01，有非常顯著性統計學意義；采用ELISA法定量檢測MSA，并做MSA診斷SCLC的ROC曲線，ACU為0.778，診斷價值中等，當然任何一種腫瘤并不簡單，幾乎都不能用單一某種標志物做出診斷。染色體分裂靠紡錘絲牽拉著絲點，本研究發現抗著絲點抗體ACA對診斷SCLC的特異性高達96.63%，準確性為76.08%，SCLC組ACA陽性率為30.11%，與肺腺癌、肺鱗癌等其他癌癥相比，經χ2檢測，均P<0.01，差異有非常顯著性統計學意義。說明細胞受紡錘體及著絲點等影響而導致分裂異?？赡苁荢CLC的發病機制之一，然而具體的抗原蛋白定位有待進一步研究，有希望在早期甚至預測為SCLC時就采取措施，阻斷其發展通路，提高診斷率和降低死亡率。

MSA、ACA陽性率在SCLC中較其他腫瘤優勢明顯，細胞分裂時紡錘體的紡錘絲與著絲點相連接，牽拉著絲點使姐妹染色體分離，本研究一致性分析顯示在SCLC中MSA與ACA一致性較差，這說明在SCLC中MSA及ACA并非簡單地以紡錘體及著絲點為抗原而產生的自身抗體。自身免疫反應產生是由于免疫系統不能識別自身抗原，腫瘤細胞自身異?？僧a生抗原，但許多抗原并非腫瘤細胞所特有，還有一種是機體腫瘤發生發展的過程中相關蛋白異常而產生的抗原。紡錘體及著絲點調控細胞分裂機制復雜，導致分裂異常的抗原蛋白可能有多種，途徑也多樣，MSA和ACA抗體的產生機制尚待進一步研究，這對研究SCLC的治療方法也存在一定價值。ANA的靶抗原包括細胞核和細胞漿等整個細胞，ANA陽性可出現在許多疾病中，特異性較差，不能確定任何疾病，在本研究中發現SCLC組ANA陽性率為24.73%，與肺腺癌、肺鱗癌相比，經χ2檢測，均P<0.05，差異均有顯著性統計學意義，雖相比其他癌癥并無明顯優勢，但對肺癌鑒別還是存在一定的價值。

綜上所述，MSA和ACA是SCLC很強的正相關危險因素，可能參與SCLC的發生發展，對SCLC的早期檢測、臨床診斷及潛在的治療應用存有一定價值。

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[收稿2016-06-14]

(編輯 倪 鵬)

Clinical significance of anti-mitotic spindle apparatus antibody (MSA) and anti-centromere antibody detected in patients with small cell lung cancer (SCLC)

TANLi-Ming,ZHANGYu-Hong,CHENJuan-Juan，LIHua，XIAOYang-Jing-Qing，WUYang，ZENGTing-Ting，TIANYong-Jian，YUJian-Lin.

DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China

Objective:To detect anti-mitotic spindle apparatus antibody (MSA) and anti-centromere antibody (ACA) and explore the clinical value for the diagnosis of small cell lung cancer (SCLC),providing clinical evidence for molecular studies of SCLC.Methods: 93 SCLC patients,208 non-small cell lung cancer (non-SCLC) patients and 50 healthy controls were enrolled in this study.MSA antibodies were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).MSA,ACA and anti nuclear antibodies (ANA) were examined by indirect immuno-fluorescence (IIF).And the results were retrospectively analyzed.Results: ① The positivity for MSA and ACA by IIF assay was respectively 36.56% and 30.11% in SCLC group,higher than other tumor groups (P<0.01).② In correlative analysis,the RR value between MSA and SCLC was as high as 12.93,12.74,and the RR value of ACA and ANA with SCLC was respectively 4.31 and 3.48.③the area under ROC (Receiver operating characteristic) curve (AUC) of MSA detection for SCLC was 0.778,with medium diagnostic value.Conclusion: MSA and ACA for SCLC are highly strong positive correlation risk factors,and may participate in the occurrence and development of SCLC,moreover,have some application value for early detection,clinical diagnosis and potential treatments of SCLC.

Small cell lung cancer;Human mitotic spindle apparatus antibodies;Anti-centromere antibodies;Antinuclear antibodies

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.021

譚立明(1963年-)，男，教授，主任技師，碩士生導師，主要從事自身免疫病的病因及抗體檢測等相關性研究，E-mail：yuuje@126.com。

R734.2

A

1000-484X(2017)03-0418-04

①本文為江西省科技廳社發項目(No.2015BBG70154)、江西省科技廳重點科技成果轉移轉化計劃(No.20151BBI90047)和江西省衛生廳科研計劃支持項目(No.20133075、20151072)。

②南昌大學醫學院，南昌330006。