歐李仁多肽的制備及其對DPPH自由基清除作用的研究

張 英，郭寶禹，張 玲，侯紅萍

（1.山西省太谷縣質量技術監督檢驗測試所，山西太谷 030800；2.山西省太谷中學校，山西太谷 030800；3.山西省農業科學院農產品加工研究所，山西太原 030031；4.山西農業大學，山西太谷 030800）

歐李仁多肽的制備及其對DPPH自由基清除作用的研究

張 英1，郭寶禹2，張 玲3，*侯紅萍4

（1.山西省太谷縣質量技術監督檢驗測試所，山西太谷 030800；2.山西省太谷中學校，山西太谷 030800；3.山西省農業科學院農產品加工研究所，山西太原 030031；4.山西農業大學，山西太谷 030800）

通過比較不同酶解液對DPPH自由基的清除能力，來確定最佳的歐李仁肽制備工藝。結果表明，3種酶復合水解得到的歐李仁多肽具有較好的清除DPPH自由基能力，IC50值為1.06 mg/mL。

酶解；歐李仁多肽；DPPH自由基

歐李（Cerasus humilis（Bge）Sok） 是我國特有的、古老的一種野生灌木果樹，果實中礦物質含量豐富，含鈣量高，也稱“鈣果”，為薔薇科櫻桃屬。對歐李進行野生果樹資源調查時發現，其具有特殊的抗旱能力，適宜在干旱地區種植，由于歐李個體小，可以作為草園栽培，與喬木果樹套種可以增加收入。此外，歐李還可用于盆景、保沙固土、水果深加工、醫療保健等方面，并能獲得較高的效益[1]。

歐李果仁中的蛋白含量遠高于其他植物，如杏、扁桃仁、核桃中蛋白含量，其中必需氨基酸的含量占總氨基酸含量的24%[2]。現在，歐李的利用主要集中在果實的初加工，如歐李果汁飲料、歐李果醋等天然保健制品[3-6]。市場上還有一些有關歐李的深加工產品，如歐李蜜餞、糖水歐李罐頭、歐李果脯等。

目前，有關對歐李仁的研究報道比較少，有人以歐李仁為原料提取營養保健油[7]，并對歐李仁中的蛋白特性進行了基礎性研究[8]，但目前也只是在試驗階段。另外，還有一些對歐李仁活性成分進行提取的研究，如歐李多酚、歐李紅色素[9-10]等。由于果實加工后會產生大量的歐李仁，歐李仁中所含大量有效成分的蛋白質并未得到充分的重視和利用。因此，試驗以歐李仁為原料制備活性肽，為植物蛋白制備活性肽提供一定的理論依據，同時也對天然抗氧化劑和免疫調節劑的應用與開發，以及歐李資源的綜合利用提供理論基礎與技術支撐。

1 材料與設備

1.1 試驗材料

歐李仁，山西農業大學植物園提供。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白酶，北京奧博星生物技術有限責任公司提供；氫氧化鈉、鹽酸，天津化工廠提供；DPPH自由基。

電子天平，JY-15A型多功能粉碎機，PHBJ-260型便攜式pH計，離心機，756型紫外可見分光光度計，JDG-0.2型真空冷凍干燥機。

2 試驗方法

2.1 歐李仁多肽的制備

2.1.1 歐李仁蛋白的提取

粉碎后的歐李仁用5倍的水分散，然后用1 mol/L的NaOH溶液調pH值至9.5，攪拌30 min并且保持上述pH值不變，以轉速4 000 r/min離心20 min，靜置后取上清液，再用1 mol/L鹽酸溶液調節pH值為4，經沉淀得到蛋白。在室溫下，以轉速4 000 r/min離心20 min，經沉淀后用蒸餾水分散，將pH值調至7，冷凍干燥處理即可得到歐李仁蛋白。

2.1.2 歐李仁蛋白不同酶解液的制備

（1）單酶水解。各種蛋白酶在各自最合適的條件下，分別對歐李仁蛋白進行水解（3種蛋白酶分別為堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶），底物質量濃度統一規定為4%（水解條件見表1），分別收集上述3種酶在30，60，90 min后的酶解液待測。

不同種類蛋白酶的水解條件見表1。

表1 不同種類蛋白酶的水解條件

（2）雙酶復合水解。首先，在最合適的條件下，將堿性蛋白酶水解30 min；然后添加胰蛋白酶，對其進行水解30 min，然后再滅酶、采集酶解液。堿性蛋白酶與中性蛋白酶按上述方法復合水解，同法中性蛋白酶與胰蛋白酶復合水解，分別收集上述3種酶解液待測。

（3）三酶復合水解。首先，在最合適的條件下，將堿性蛋白酶水解30 min，然后添加胰蛋白酶水解30 min，最后加入中性蛋白酶繼續水解30 min，滅酶后收集酶解液待測。

2.1.3 不同種類的酶解液對DPPH自由基清除率的對比

按照參考文獻[11]的方法，先配制125 μmoL/L的DPPH·無水甲醇溶液，然后在試管中分別加入不同的歐李仁蛋白酶解液2 mL，DPPH·（125 μmoL/L）溶液2 mL，劇烈的震蕩，并靜置30 min，然后在517nm處測定吸光度（Ai）。在另外2支試管中，分別加入待測液2 mL和甲醇2 mL作為對照樣品（Aj），DPPH·溶液2 mL和甲醇2 mL作為空白（Ac），再按上面所述方法測定吸光度。根據下列公式分別計算出各待測樣品對DPPH自由基的清除率，并且平行重復3次，再取平均值。

式中：Ai——DPPH·試劑與樣品液混合液的吸光度；

Aj——空白溶劑與樣品液混合液的吸光度；

Ac——空白溶劑與DPPH·試劑混合液的吸光度。

2.2 數據統計與分析

數據用SPSS軟件處理，通過單因子方差分析（One-way ANOVN，LSD）進行差異顯著性檢驗，數據以X±SD表示。

3 結果與分析

3.1 歐李仁多肽酶解法的篩選

歐李仁蛋白不同酶解液對DPPH自由基清除率的影響見圖1。

圖1 歐李仁蛋白不同酶解液對DPPH自由基清除率的影響

由圖1可知，歐李仁蛋白經堿性蛋白酶水解后的酶解液，由于水解時間的延長，對DPPH自由基的清除率也隨著逐漸上升。水解30 min后清除率為43.2%，當水解90 min后清除率可達79.1%；酶解液經胰蛋白酶水解后，由于水解時間的增加，對DPPH自由基的清除率也逐漸增加，水解90 min后清除率可達到81.4%；用中性蛋白酶水解的酶解液，于30，60，90 min后對DPPH自由基的清除率分別為64.7%，75.1%，78.7%；經堿性蛋白酶和胰蛋白酶分步復合水解后的歐李仁蛋白酶解液對DPPH自由基的清除率為80.5%；堿性蛋白酶與中性蛋白酶按上述方法復合水解酶解液的清除率達到81.2%；中性蛋白酶與胰蛋白酶復合水解后其清除率達到80.6%；但是由上述3種酶復合水解后的酶解液對DPPH自由基的清除率最高達到93.4%。因此，以DPPH自由基的清除率為指標，確定歐李仁抗氧化肽最佳酶解工藝為先將堿性蛋白酶在最適合條件下水解30 min，然后再加入胰蛋白酶水解30 min，最后再加入中性蛋白酶繼續水解30 min，然后滅酶收集酶解液，再經冷凍干燥處理得到歐李仁抗氧化肽。

3.2 歐李仁多肽對DPPH自由基清除率的影響

歐李仁活性肽對DPPH自由基的清除作用見圖2。

由圖2可知，歐李仁活性肽質量濃度1～4 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除作用隨著質量濃度的增加幾乎呈直線上升；當質量濃度為4 mg/mL時，DPPH自由基清除率已達到83.3%；隨著質量濃度繼續升高，歐李仁多肽對DPPH自由基的清除率接近100%；而當質量濃度為8 mg/mL時，DPPH自由基清除率可達95.5%。試驗所得數據用Excel進行多項式回歸，回歸方程為Y=-0.014 2X2+0.193 2X+0.311 1，R2=0.972 2，通過利用回歸方程計算，最后得出歐李仁活性肽清除DPPH自由基的IC50值為1.06 mg/mL。

圖2 歐李仁活性肽對DPPH自由基的清除作用

4 結論

試驗是由堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶3種酶通過分步、復合水解歐李仁蛋白，從而使制備的歐李仁多肽具有比較好的清除DPPH自由基能力，IC50值為1.06 mg/mL。

5 討論

通過蛋白水解獲得的活性物質擁有多種生物功能，尤其以抗氧化能力最為明顯。抗氧化肽類，因為其分子量小、具有高活性功能、容易被人體吸收等優點而被大范圍研究。生物活性肽的抗氧化作用主要是指清除自由基的能力、抑制脂質過氧化及螯合金屬離子的能力，在試驗中經常利用清除DPPH自由基的能力以確定物質抗氧化活性的強弱。試驗研究表明，特異性氨基酸序列和活性肽結構是決定活性肽抗氧化作用強弱的主要因素。試驗對歐李仁活性肽的制備方法及其對清除DPPH自由基的作用做了初步研究，其歐李仁多肽的空間結構還有待進一步深入研究。

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Preparation and the Effect on the DPPH Free Radical of the Cerasus Humilis Kernel Peptide

ZHANG Ying1，GUO Baoyu2，ZHANG Ling3，*HOU Hongping4
（1.Taigu County Quality and Technical Supervision and Inspection Institute，Taigu，Shanxi 030800，China；2.Middle School in Taigu，Taigu，Shanxi 030800，China；3.Processing Institute，Shanxi Agricultural Science Academy，Taiyuan，Shanxi 030031，China；4.Shanxi Agricutural University，Taigu，Shanxi 030800，China）

CHKPs are prepared by hydrolysis with alkaline protease，trypsin and neutral protease followed by comparing the effects of different enzyme solution on the DPPH free radical scavenging ability to determine the best process for preparation of the CHKPs.The CHKPs can scavenge 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） （IC501.06 mg/mL）.

hydrolysis；Cerasus humilis kernel peptide；DPPH free radical

R151

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.002

1671-9646（2017）02a-0006-03

2016-12-02

張 英（1985— ），女，碩士，工程師，研究方向為食品科學。

*通訊作者：侯紅萍（1965— ），女，博士，教授，研究方向為食品與發酵工程。