自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用

王智華，田首元，王建剛，賀 萱，朱 健

自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用

王智華1，田首元2，王建剛2，賀 萱1，朱 健2

目的 探討自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用。方法 選用雄性SD大鼠(220 g～260 g)35只，隨機分為5組：假手術組(S組)、心肌缺血再灌注損傷組(I/R組)、舒芬太尼后處理組(SP組)、舒芬太尼后處理+PI3K-Akt通路的抑制劑Wortmannin組(SP+W組)、Wortmannin組(W組)。I/R組、SP組、SP+W組以及W組采用結扎冠脈左前降支(LAD)30 min、再灌注120 min的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。S組在冠脈左前降支(LAD)下穿線但不結扎。于再灌注前5 min，I/R組由股靜脈給予生理鹽水1 mL，SP組給予舒芬太尼(1 μg/kg)，SP+W組給予舒芬太尼(1 μg/kg)及Wortmannin(15 μg/kg)，W組給予Wortmannin(15 μg/kg)。再灌注120 min時腹主動脈取血，檢測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)的濃度；處死大鼠后，取心尖組織，Western blot法檢測Akt、磷酸化的Akt(p-Akt)、LC3-Ⅱ的表達；電鏡下觀察自噬體的生成情況。結果 與S組比較，I/R組、SP組、SP+W組及W組CK-MB含量、LC3-Ⅱ表達增加，p-Akt/Akt升高，差異有統計學意義(P<0.05)，自噬體數量增多；與I/R組比較，SP組CK-MB含量、LC3-Ⅱ表達減少，p-Akt/Akt升高，差異有統計學意義(P<0.05)，自噬體數量減少；與SP組比較，SP+W組、W組CK-MB含量、LC3-Ⅱ表達增加，p-Akt/Akt降低，差異有統計學意義(P<0.05)，自噬體數量增多。結論 舒芬太尼后處理可能通過抑制自噬水平而在心肌缺血再灌注損傷中起到保護作用，其中PI3K-Akt通路可能是主要通路之一。

心肌缺血；再灌注損傷；自噬；舒芬太尼；PI3K-Akt通路

大量實驗已經表明缺血后處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷[1]。前期研究表明：舒芬太尼后處理可以起到心肌缺血再灌注損傷保護作用，且與PI3K-Akt通路有關[2]。同時亦有研究表明在缺血再灌注損傷中，自噬過度表達是心肌再灌注損傷的因素之一[3]，而PI3K-Akt通路是自噬調控的一條經典通路[4]，本研究嘗試探討舒芬太尼后處理是否通過抑制自噬產生保護作用，同時探討PI3K-Akt通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠35只(SPF級)，220 g～260 g，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。35只SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為5組：假手術組(S組)、缺血再灌注損傷組(I/R組)、舒芬太尼(宜昌人福藥業有限責任公司，批號1150316)后處理組(SP組)、舒芬太尼后處理+PI3K-Akt通路的抑制劑渥曼青霉素(Wortmannin，山西普興生化工程有限公司，批號20150503)組(SP+W組)、Wortmannin組(W組)。

1.2 方法

1.2.1 實驗模型制備 實驗前大鼠禁食8 h以上，自由飲水，20%烏拉坦(5 mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，將大鼠腹部朝上，四肢固定，在其皮下插入電極，連接心電圖機，觀察記錄正常Ⅱ導聯心電圖。然后頸部正中作氣管切開，插入導管后固定，連接動物呼吸機人工通氣(設置潮氣量3 mL/100 g，頻率70次/min)。于左胸壁心臟搏動最明顯處開胸，在心臟表面尋找左冠狀動脈前降支(LAD)，不明顯則選擇左耳根部下方2 mm處定位，以6-0帶針線穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針，活結結扎LAD，造成心前區缺血，以LAD供血區顏色青紫或蒼白色、心電圖ST段抬高作為缺血標準。缺血30 min后，松開結扎線，再灌注120 min，以缺血區顏色變紅，心電圖ST段恢復基礎水平或降低明顯作為標準。

1.2.2 實驗分組處理 S組于LAD下方穿線，不結扎；再灌注前5 min；I/R組由股靜脈給予生理鹽水1 mL；SP組給予舒芬太尼稀釋液1 mL(1 μg/kg)，SP+W組給予舒芬太尼稀釋液(1 μg/kg)及Wortmannin稀釋液(15 μg/kg)共1 mL，W組給予Wortmannin稀釋液(15 μg/kg)1 mL。

1.2.3 心肌Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ蛋白表達測定 各組分別取4只大鼠，再灌注120 min時腹主動脈取血，然后處死大鼠，剪取缺血心尖心肌組織，生理鹽水沖洗血液。將部分缺血心尖心肌組織剪碎，按組織重量(100 mg)加入RIPA裂解液1 mL、10 μL苯甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制劑)、10 μL廣譜磷酸酶抑制劑，置于4 ℃冰箱3 h后離心(13 000 r/min，15 min)，取上層清液，采用BCA法測定蛋白濃度(裂解相關試劑及BCA蛋白定量試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司)。依據測定的蛋白含量結果，加入蛋白及緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后，在12%分離膠/5%集成膠上進行電泳，在電轉儀(15 V，15 min)上將凝膠上的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后用5%牛血清蛋白在4 ℃下封閉2 h。封閉后洗膜，然后加入兔抗鼠Akt單克隆抗體(稀釋度1∶7 500，ABCAM公司，批號ab32505)、兔抗鼠p-Akt單克隆抗體(稀釋度1∶5 500，ABCAM公司，批號ab108266)和兔抗鼠單克隆LC3-Ⅱ(稀釋度1∶1 000，CST公司，批號3868S)，4 ℃下孵育過夜，孵育完成后洗膜，加入羊抗兔二抗(稀釋度1：3 500，博士德生物工程有限公司，批號BA1054)，反應2 h后顯影曝光，以目標蛋白條帶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值得比值反映Akt、p-Akt和LC3-Ⅱ的表達水平。

1.2.4 心肌損傷標記物肌酸激酶同工酶(CK-MB)測定 腹主動脈取血后離心，取上層血清，ELISA法檢測血清中CK-MB的含量，評估心肌損傷情況。

1.2.5 自噬小體觀測 將另一部分心尖心肌組織剪成1 mm3大小，置于固定液中，制片后觀察自噬小體生成情況。

2 結 果

2.1 血清CK-MB比較 與S組比較，I/R組、SP組、

SP+W組、W組血清CK-MB增多，差異有統計學意義(P<0.05)；與I/R組相比較，SP組CK-MB降低，差異有統計學意義(P<0.05)，SP+W組、W組CK-MB與I/R組差異無統計學意義(P>0.05)；與SP組相比較，SP+W組、W組CK-MB增多，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 心肌細胞Akt、p-Akt以及自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達 與S組比較，I/R組、SP組、SP+W組、W組p-Akt/Akt增高，LC3-Ⅱ表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)；與I/R組比較，SP組p-Akt/Akt增高，LC3-Ⅱ表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，SP+W組、W組差異無統計學意義；與SP組比較，SP+W組、W組p-Akt/Akt降低，LC3-Ⅱ表達增多，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

圖1 心肌細胞Akt、p-Akt以及自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達

組別nCK?MB(pg/mL)Aktp?Aktp?Akt/AktLC3?ⅡS組70．330±0．0560．805±0．0110．301±0．0140．374±0．016 0．398±0．050 I/R組71．178±0．0540．821±0．0120．437±0．0160．533±0．0221) 1．124±0．0991) SP組70．598±0．1110．838±0．0140．562±0．0220．671±0．0251)2)0．581±0．0451)2) SP+W組71．112±0．0380．842±0．0310．446±0．0150．530±0．0081)3)1．219±0．1251)3)W組 71．170±0．0820．831±0．0200．422±0．0210．509±0．0331)3)1．114±0．0451)3) 與S組比較，1)P<0．05；與I/R組比較，2)P<0．05；與SP組比較，3)P<0．05。

2.3 電鏡下病理學觀察 S組未觀察到自噬體；多個視野下I/R組比S組自噬體增多；多個視野下SP組比I/R組減少。詳見圖2。

圖2 電鏡下病理學觀察

3 討 論

前期研究[5]以及相關文獻[6]證實舒芬太尼對大鼠心肌的最佳保護劑量為1 μg/kg，且舒芬太尼的血漿濃度達峰時間為2 min左右，因此于再灌注前5 min單次股靜脈給予舒芬太尼1 μg/kg后處理可以起到相應的保護作用。本實驗參考相關文獻[2]制備大鼠心肌缺血再灌注模型。實驗結果顯示：I/R組血清CK-MB明顯升高，提示缺血再灌注模型制備成功。SP組與I/R組相比，血清CK-MB降低，提示舒芬太尼后處理可以在心肌缺血再灌注損傷中起到保護作用。

自噬現象在心肌細胞生理狀態下即存在以維持穩態，一般認為在缺血再灌注時期，自噬表達會有一定增強。自噬過程的調節是一個較為復雜的過程，多種信號通路以及信號分子參與自噬的調控，其中較為經典且研究較多的是PI3K-Akt通路[7]，一般認為在缺血階段自噬激活有利于細胞存活；再灌注時期，細胞缺氧、內質網應激等似的自噬過度增強，從而對細胞存活產生不利影響[8-9]。LC3是自噬常用檢測分子，其在自噬泡的形成過程中起到重要作用，其具體表現為LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例上升，自噬活性相應提升。既往研究表明：舒芬太尼可通過激活PI3K-Akt通路從而產生再灌注損傷保護作用[10]。本次實驗I/R組自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達增加，提示自噬參與缺血再灌注損傷過程；SP組LC3-Ⅱ表達減少，提示舒芬太尼抑制自噬產生而保護作用；SP組p-Akt表達增多，提示舒芬太尼可能通過激活PI3K-Akt通路而抑制自噬；SP+W組LC3-Ⅱ表達與I/R組比較差異無統計學意義，且渥曼青霉素阻斷PI3K-Akt通路后，p-Akt表達減少，自噬表達增多，提示PI3K-Akt通路可能是自噬通路中較主要的一條通路。

綜上所述，舒芬太尼后處理可通過抑制自噬水平而在缺血再灌注損傷中起到保護作用，其中PI3K-Akt通路可能是主要參與機制之一。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Autophagy and PI3K-Akt Pathway in Sufentanil Postconditioning on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury Protection

Wang Zhihua，Tian Shouyuan，Wang Jiangang，He Xuan，Zhu Jian

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China Corresponding Author：Tian Shouyuan (The First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan，Shanxi，China)

Objective To investigate the roles of autophagy and PI3K-Akt signaling pathway on sufentanil postconditioning-mediated alleviation of myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). Methods Thirty-five male Sprague-Dawley (SD) rats weighed 220 g to 260 g were randomly divided into five groups (n=7 each)：Sham operation group (group S)，ischemia-reperfusion group(group I/R)，Sufentanil postconditioning group (group SP)，sufentanil postconditioning plus Wortmannin (a specific PI3K inhibitor) group (group SP+W) and Wortmannin group (group W).In groups I/R，SP，SP+W and W，the myocardial I/R models were prepared by 30 min ligation of left anterior descending coronary artery(LAD) followed by 120 min reperfusion. Group S underwent the operation with a stitch placed around but not ligating the artery.In groups I/R，SP，SP+W and W rats were treated with 1 mL normal saline，1 μg/kg sufentanil，1 μg/kg sufentanil plus 15 μg/kg wortmannin and 15 μg/kg wortmannin intravenous infusion via the femoral vein for 5 min prior to reperfusion，respectively. Abdominal aortic blood samples were collected at 120 min of reperfusion for measurement of the serum creatine kinase-MB (CK-MB) concentration. The cardiac apexes were collected after executed the rats.The expression of Akt，phosphorylated-Akt (p-Akt) and LC3-Ⅱ were detected by Western blotting and the formation of autophagy was observed by electron microscope.Results Compared with group S，the concentration of CK-MB and the expression of LC3-Ⅱ increased in groups I/R，SP，SP+W and W，the ratio of p-Akt/Akt higher in groups I/R，SP，SP+W and W (P<0.05) and the formation of autophagy was increased. Compared with group I/R，the concentration of CK-MB and the expression of LC3-Ⅱ decreased in group SP，the ratio of p-Akt/Akt higher in group SP (P<0.05)and the formation of autophagy was decreased. Compared with group SP，the concentration of CK-MB and the expression of LC3-Ⅱ increased in groups SP+W and W，the ratio of p-Akt/Akt lower in groups SP+W and W(P<0.05)and the formation of autophagy was increased.Conclusion Sufentanil postprocessing through inhibition of autophagy in myocardial ischemia reperfusion injury play a protective role，including PI3K-Akt pathway may be one of the main mechanisms.

myocardial ischemia-reperfusion injury；autophagy；sufentanil；PI3K-Akt pathway

山西省自然科學基金面上項目(No.2014011040-4)

1.山西醫科大學(太原 030001)；2.山西醫科大學第一醫院

田首元，E-mail：chinatsyjj@126.com

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.04.008

1672-1349(2017)04-0415-04

2016-11-02)

引用信息：王智華，田首元，王建剛，等.自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(4)：415-418.