京尼平苷調控大鼠胰島素分泌的機制研究

劉云峰，丁亞琴，鐘向琴，任樂樂，白 濤，，劉萌萌，章 毅

京尼平苷調控大鼠胰島素分泌的機制研究

劉云峰1，丁亞琴2，鐘向琴2，任樂樂2，白 濤1，2，劉萌萌2，章 毅2

目的 探討京尼平苷在大鼠胰島素分泌中的作用及其機制，為糖尿病的治療提供依據。方法 將膠原酶P經膽總管注入雄性Wistar大鼠的胰腺，消化11 min，histopaque 1077 梯度離心得到分離純化的胰島。用放射免疫分析法檢測胰島素分泌功能，采用ELISA方法檢測環鱗酸腺苷(cAMP)含量，通過膜片鉗技術記錄電壓依賴性鉀通道(Kv)電流和Ca2+電流。結果 在8.3 mmol/L的葡萄糖下，京尼平苷可促進胰島素分泌，給予exendin(9-39)、SQ22536和H89，可明顯減弱京尼平苷的胰島素分泌量以及環磷酸腺苷的含量，且在電壓依賴性鉀電流中也有相同的抑制作用。此外，京尼平苷調控胰島素分泌作用還受到鈣電流的影響。結論 京尼平苷通過、cAMP信號通路及其下游受體PKA來發揮調控胰島素分泌的作用。

京尼平苷；胰島素分泌；胰高血糖素樣肽-1；環磷酸腺苷；電壓依賴性鉀通道

糖尿病在我國已成為一個日益嚴重的公共衛生問題，其中絕大部分(95%)是2型糖尿病，發病原因包括胰島素分泌的缺陷和胰島素敏感性的增加。胰島素分泌缺陷有很多種，包括胰島素的不應答[1]、葡萄糖刺激后胰島素早期階段的分泌缺失[2]、血漿中基礎胰島素及刺激后胰島素濃度的降低[3]以及進行性降低的胰島素分泌能力[4]等。因此，調節胰腺β細胞的胰島素分泌能力對預防和治療2型糖尿病非常重要。

近年來，越來越多的數據表明胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)可通過其受體來調節胰島素分泌和葡萄糖代謝，然而，GLP-1的半衰期非常短，在循環系統中迅速被二肽基肽酶-4(DPP Ⅳ)降解，存在時長不超過2 min[5]，因此研究能夠激動GLP-1的小分子類化合物具有重要價值。其中京尼平苷(GP)作為GLP-1受體(GLP-1R)的激動劑備受關注，有報道稱京尼平苷具有抗糖尿病作用[6]，并且通過激活GLP-1R促進了胰島細胞瘤細胞(INS-1)系的胰島素分泌[7-8]。本研究旨在闡明京尼平苷在急性分離大鼠胰島組織及原代胰島β細胞中的作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar大鼠，由北京中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，體重220 g～260 g。飼養環境：溫度23 ℃±3 ℃，濕度(50±5)%。

1.1.2 試劑 膠原酶P(Roche，Indianapolis，USA)，Dispase II(Roche，Indianapolis，USA)，1640培養基(Hyclone Beijing，China)，Histopaque 1077(Sigma，USA)，京尼平苷(Marker Inc，China)，exendin(9-39)(Abgent，San Diego，CA)，SQ22536(Cayman Chemical，Ann Arbor，Mich USA)，H89(Cayman Chemical，Ann Arbor，Mich，USA)，胰島素檢測試劑盒(北方生物技術公司，北京)，Elisa檢測試劑盒(北方生物技術公司，北京)。

1.1.3 主要儀器 EPC10全自動膜片鉗(HEKA，Germany)；細胞培養箱(北京博奧恒信生物科技有限公司)；臺式離心機(長沙湘儀儀器有限公司)；Narishige MODEL PP830 電極拉制儀、MIROFORGE MF830拋光儀(日本 Narishige)。

1.2 方法

1.2.1 胰島、胰島細胞的分離及培養 將Wistar大鼠的腹部剪開，充分暴露胰腺，將1 mg/mL膠原酶P經膽總管注入胰腺內，水浴消化11 min后，加入histopaque 1077進行梯度離心，在顯微鏡下挑選胰島。將胰島置于含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的1640培養基中，并在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。單個胰島細胞由胰島經dispaseⅡ消化所得。

1.2.2 胰島素分泌實驗 配制KRBH孵育液，分組，每組7個Ep管，分別編號，于體視顯微鏡下挑取狀態良好、大小均勻的胰島，放入含 800 μL 2.8 mmol/L葡萄糖的 KRBH 緩沖液，每管5個胰島，37 ℃預孵育半小時后棄上清。然后每管分別加入含不同濃度的葡萄糖和藥物的KRBH 緩沖液 ，37 ℃孵育半小時，各自收集上清后進行標號，-20 ℃保存，待測。收集上清的過程中避免將胰島吸出，加入酸乙醇裂解液，超聲粉碎胰島，-20 ℃保存待測。用放射免疫試劑盒檢測上述各待測樣品，測得的胰島素含量均使用胰島素總量標化后進行分析。

1.2.3 膜片鉗技術 胰島細胞種在蓋玻片上，在室溫(22 ℃～25 ℃)下采用EPC-10放大器和PULSE軟件，并在全細胞模式下進行電流記錄。電壓依賴性鉀(Kv)電流的記錄需要將細胞與電極形成穩定GΩ封接，在-70 mV的鉗制電壓下給予細胞-70 mV～80 mV的電壓刺激，破膜后記錄400 ms內的電流變化。細胞電容大于7pF被認為是β細胞[9]。細胞外液：141.9 mmol/L NaCl，5.6 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgCl2，11.1 mmol/L 葡萄糖，5 mmol/L HEPES，用NaOH 調節PH為7.4。 細胞內液：10 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，0.05 mmol/L EGTA，140 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，用KOH將pH調為7.3。

2 結 果

2.1 exendin(9-39)在京尼平苷調控胰島功能中發揮的作用 與2.8 mmol/L的糖濃度(2.8G)相比，8.3 mmol/L的葡萄糖(8.3G)可促進胰島素分泌，在此條件下，京尼平苷促胰島素分泌量明顯增加。我們的前期工作已證實，京尼平苷在10 μmol/L的濃度達最佳促分泌效應，故本實驗所用京尼平苷濃度均為10 μmol/L。應用GLP-1R阻斷劑exendin(9-39)后，可明顯減弱京尼平苷的促胰島素分泌作用。環磷酸腺苷(cAMP)含量測定發現，在8.3 mmol/L的糖濃度條件下，京尼平苷顯著增加了胰島cAMP的含量，exendin(9-39)明顯減弱了此作用。通過電生理膜片鉗實驗發現，exendin(9-39)可逆轉京尼平苷對Kv電流的抑制作用。因此，認為京尼平苷通過GLP-1R發揮調控胰島各功能的作用。詳見表1。

表1 Exendin(9-39)在京尼平苷調控胰島功能中發揮的作用(±s)

2.2 cAMP信號通路參與京尼平苷調控胰島素分泌過程 腺苷酸環化酶(AC)抑制劑SQ22536減弱了京尼平苷促胰島素分泌的作用，應用AC 激動劑Forsklin則明顯促進了胰島素分泌，與京尼平苷組相比差異有統計學意義(P<0.01)。為了進一步驗證，本研究采用Elisa方法檢測cAMP含量，結果顯示，京尼平苷誘導的cAMP含量在SQ22536作用下顯著降低，且Forsklin明顯增加了相同胰島組織的cAMP含量。這些數據充分說明京尼平苷通過AC/cAMP信號途徑發揮作用。詳見表2。

表2 SQ22536對京尼平苷誘導的胰島素分泌及cAMP含量的影響(±s)

2.3 依賴性蛋白激酶A(PKA)信號途徑在京尼平苷調控胰島功能中發揮的作用 應用PKA抑制劑H89觀察其對京尼平苷作用的影響，結果顯示：H89減弱了京尼平苷對胰島素的促分泌效應和對Kv電流的抑制作用，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 H89對京尼平苷誘導的胰島素分泌及Kv電流的影響(±s)

2.4 京尼平苷對鈣通道的影響 應用膜片鉗技術來檢測鈣離子通道在京尼平苷調控胰島素分泌中所發揮的作用，與對照組相比，京尼平苷可明顯增加鈣離子電流密度。詳見表4。

表4 京尼平苷對鈣離子電流的影響(±s)

3 討 論

有研究表明：京尼平苷在動物中具有抗糖尿病作用[10]，在INS-1細胞系的研究中發現可通過GLP-1R調控胰島素分泌[8]，然而在原代胰島β細胞中京尼平苷是如何發揮作用以及其作用機制尚缺乏足夠研究。

本研究中發現京尼平苷在高糖(8.3 mmol/L)濃度下可促進胰島素分泌，同樣條件下，應用exendin(9-39)可明顯減弱這一促分泌效應，且排除exendin(9-39)本身對胰島功能的影響。因此可說明京尼平苷確實是通過GLP-1R發揮作用。

有報道稱，cAMP信號途徑在GLP-1R調控胰島素分泌中發揮重要作用[11]。本實驗通過應用腺苷酸環化酶的拮抗劑SQ22536和激動劑Forsklin來驗證cAMP信號通路所發揮的作用。實驗結果表明：SQ22536可明顯減弱京尼平苷的作用，Forsklin作為陽性對照可明顯的促進胰島素分泌，SQ22536本身與對照組相比差異無統計學意義。

在胰島β細胞中，大多數GLP-1需要激活細胞內cAMP PKA信號通路發揮作用[12]；也有學者認為存在第二種機制，即GLP-1增強了cAMP調節的鳥嘌呤核苷酸交換因子(cAMP-GEF)Epac2的作用，而此作用是不依賴PKA的[13]。總的來說，PKA活性在刺激腸促胰島素進行胞外分泌過程中發揮重要作用[14]。本研究結果也證實，在排除PKA抑制劑H89本身影響之外，應用H89明顯削弱了京尼平苷的促分泌作用。

cAMP含量的檢測結果也表明，exendin(9-39)、SQ22536和H89可逆轉京尼平苷對cAMP含量的影響。我們的前期實驗已證實，京尼平苷可抑制電壓依賴性鉀通道發揮調控胰島素分泌的作用，本研究中我們采用膜片鉗技術檢測exendin(9-39)和H89對京尼平苷抑制Kv作用的影響，結果證實二者均可減弱京尼平苷對Kv的抑制效應。

此外，胰島素分泌活動還受到鈣離子的調控，即胰島素分泌的鈣依賴性[15]，膜片鉗實驗結果表明，與對照組相比，鈣電流密度在京尼平苷的干預下顯著增加(P<0.001)，證明鈣離子參與了京尼平苷調控胰島素分泌的過程。

綜上所述，京尼平苷作為GLP-1R的小分子激動劑，通過GLP-1R/cAMP/PKA信號通路發揮其促胰島素分泌作用，且只在高糖情況下發揮作用，是一種具有葡萄糖濃度依賴性的新型胰島素促泌劑，避免了臨床常見的低血糖反應，極大地擴充了糖尿病藥物的范疇，對預防和治療糖尿病具有重要的意義。

[1] Bergsten P.Pathophysiology of impaired pulsatile insulin release[J].Diabetes Metab Res Rev，2000，16：179-191.

[2] Kano Y，Kanatsuna T，Nakamura N，et al. Defect of the first-phase insulin secretion to glucose stimulation in the perfused pancreas of the nonobese diabetic (NOD) mouse[J]. Diabetes，1986，35：486-490.

[3] Hartter E，Svoboda T，Ludvik B，et al. Basal and stimulated plasma levels of pancreatic amylin indicate its co-secretion with insulin in humans[J].Diabetologia，1991，34：52-54.

[4] Guillausseau PJ，Meas T，Virally M，et al. Abnormalities in insulin secretion in type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Metab，2008，34(Suppl 2)：S43-S48.

[5] Ahren B，Winzell MS，Wierup N，et al. DPP- 4 inhibition improves glucose tolerance and increases insulin and GLP-1 responses to gastric glucose in association with normalized islet topography in mice with beta-cell-specific overexpression of human islet amyloid polypeptide[J]. Regul Pept，2007，143：97-103.

[6] Kimura Y，Okuda H，Arichi S. Effects of geniposide isolated from Gardeniajasminoides on metabolic alterations in high sugar diet-fed rats[J]. Chem Pharm Bull，1982，30：4444-4447.

[7] Liu J，Guo L，Yin F，et al. Geniposide regulates glucose stimulated insulin secretion possibly through controlling glucose metabolism in INS-1 cells[J]. PLos One，2013，8 ：e78315.

[8] Guo LX，Xia ZN，Gao X，et al. Glucagon-like peptide 1 receptor plays a critical role in geniposide-regulated insulin secretion in INS-1 cells[J]. Acta Pharmacol，2012，33： 237-241.

[9] Gopel S，Kanno T，Barg S，et al. Voltage-gated and resting membrane currents recorded from B-cells in intact mouse pancreaticislets[J]. J Physiol，1999，521： 717-728.

[10] Wu SY，Wang GF，Liu ZQ，et al. Effect of geniposide，a hypoglycemic glucoside，on hepatic regulating enzymes in diabetic mice induced by a high-fat diet and streptozotocin[J]. Acta Pharmacol Sin，2009，30：202-208.

[11] Ramos LS，Zippin JH，Kamenetsky M，et al. Glucose and GLP-1 stimulate cAMP production via distinct adenylyl cyclases in INS-1E in sulinoma cells[J]. J Gen Physiol，2008，132：329-338.

[12] Drucker DJ，Nauck MA. The incretin system：glucagon-likepeptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes[J].Lancet，2006，368：1696-1705.

[13] Seino S，Shibasaki T.PKA-dependent and PKA-independentpathways for cAMP-regulated exocytosis[J]. Physiol Rev，2005，85：1303-1342.

[14] Chepurny OG，Kelley GG，Dzhura I，et al. PKA-dependent potentiation of glucose-stimulated insulin secretion by Epac activator 8-pCPT-20-O-Me-cAMP-AM in human islets of Langerhans[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298：E622-E633.

[15] Henquin JC. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose[J]. Diabetes，2000，49：1751-1760.

(本文編輯郭懷印)

國家自然科學基金(No.81273564，81373464，81670710)；山西省留學回國人員科技活動項目擇優資助(No.2016-97)；山西醫科大學第一醫院青年創新基金(No.YC1422)

1.山西醫科大學第一醫院(太原 030001)，E-mail：nectarliu@163.com；2.山西醫科大學

引用信息：劉云峰，丁亞琴，鐘向琴，等.京尼平苷調控大鼠胰島素分泌的機制研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(4)：425-427.

R541.7 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.04.010

1672-1349(2017)04-0425-03

2016-10-19)