響應面法提取煙葉有效物質工藝優化

張呂鴻，王成卓，肖曉明*，趙世民，李豪豪，王玉潔，張趙鵬，姜　斌

(1.天津大學化工學院，天津 300072； 2.洛陽煙草公司，河南 洛陽 471000; 3.浙江中煙工業有限責任公司，杭州 310008)

我國是世界上最大的煙草生產國，每年有大約25%的煙葉被廢棄[1]，不僅造成了巨額經濟損失，也帶來了巨大的生態環境污染。廢棄煙葉中含有大量有效成分，不僅有重要的經濟價值，還有重要的醫藥價值。合理的利用廢棄煙葉是我國煙葉產業可持續發展的重要保障[2]。常用的煙葉致香成分提取方法有：水蒸氣蒸餾[3]、溶劑萃取[4]、同時蒸餾萃取(SE-SD)[5]、微波輔助溶劑萃取 (MASE)[6-7]等。高宏建等[8]對煙草精油的水蒸氣蒸餾法提取工藝進行了研究，通過單因素試驗及正交試驗的方法得到最適宜提取條件，并獲得了1.7%的精油收率。楊再波等[9]采用同時蒸餾萃取方法，研究了烤煙煙梗中揮發性香氣成分的組成，鑒定出39種香氣成分。張獻忠等[10]采用溶劑提取法對廢棄煙葉進行了萃取研究，共鑒定致香物質91種，得到浸膏產率約為3.38%。以上研究均取得了較為顯著的成果，但這些研究均未提及到煙葉中含量較高的α-維生素E(α-Tocopherol)的提取。周等[11]研究了微波輔助溶劑提取法提取煙葉中茄尼醇的工藝，但并未報道發現天然維生素E。盡管同時蒸餾萃取和微波輔助溶劑提取法相比溶劑提取法有諸多優勢，但不適合煙葉中天然維生素E的提取。為了更好地利用廢棄煙葉資源，選取溶劑提取法對煙葉精油以及天然維生素E進行了提取研究，并采取響應面法對提取工藝進行優化。

1　材料與方法

1.1　實驗材料和分析方法

實驗所用廢棄煙葉產自洛陽地區，于35 ℃下真空干燥4 h。粉碎后過30、40、50、60和70目篩密封保存備用。

所有有機試劑(N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、乙醚、環己烷)均購自天津市江天化工科技有限公司，分析純。

實驗中定性分析由安捷倫公司氣質聯用儀(GC-MS，Agilent 7890A-5975)、定量分析由氣相色譜儀(GC，Agilent 7890B)完成。色譜條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度選定為260 ℃，進樣量選定為1 μL，分流比選定為5∶1，載氣為氦氣，載氣流量選定為5 mL/min，升溫程序選定為50 ℃保持2 min，4 ℃/min升溫至230 ℃，1 ℃/min升溫至255 ℃。

1.2　單因素實驗設計

所有單因素對實驗結果的影響用提取率評定：

(1)

其中Y為提取率，%；m為所得精油質量，g；M為所用煙末質量，g。

稱取煙末15 g，放置于250 mL三口燒瓶中，并置入一定量萃取劑，在一定溫度下水浴攪拌萃取一定時間。合并萃取液，脫除提取劑之后計算提取率，重復3次實驗，并進行定性、定量分析。單因素實驗安排如表1所示。單因素實驗所得最適宜實驗條件將被選為下一單因素實驗條件。

表1　各單因素實驗設計

提取次數單因素實驗其他實驗條件為：提取溫度40 ℃，物料細度60目，提取時間6.0 h，物料比10 mL/g。提取溫度單因素實驗其他實驗條件為：物料細度60目，提取時間6.0 h，物料比10 mL/g。物料細度單因素實驗其他實驗條件為：提取溫度40 ℃，提取時間6.0 h，物料比10 mL/g。提取時間單因素實驗其他實驗條件為：提取溫度40 ℃，物料細度50目，物料比10 mL/g。物料比單因素實驗其他實驗條件為：提取溫度40 ℃，物料細度50目，提取時間6.0 h。

1.3　響應面法優化提取工藝

根據單因素實驗結果，選取提取溫度、提取時間、提取物料比為獨立變量(分別以A、B、C表示)進行響應面法實驗優化提取工藝。如表2所示，根據BBD方法設計三因素三水平共計17組實驗。

表2　響應面法實驗因素水平表

實驗通過Design-Expert 8.0.6設計，以A、B、C為自變量，以提取率Y為響應值，實驗結果通過式(2)進行多元擬合回歸。

(2)

其中Y為響應值，Xk與Xj為獨立變量；i與j為實驗設計變量；β0為模型距；βk，βkk與βkj為自變量的回歸系數、線性和二元交互系數。

2　結果與討論

2.1　提取溶劑的選擇

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙醇、丙酮、乙醚和環己烷的提取效果如圖1和圖2所示。

圖1　不同溶劑提取效率Fig.1　Extraction yields of different solvents

圖2　不同溶劑提取物主要成分表Fig.2　Major constituents of tobacco oleoresin extracted by different solvents

從圖1和圖2中可以看出，乙醇做溶劑時，浸膏提取率以及煙堿和維生素E的提取效率均達到最大。同樣，DMF作為萃取劑，雖然浸膏提取率較高，但是DMF本身黏度較大，不利于后期脫除溶劑、保護熱敏性物質，而且在DMF提取物中并未發現維生素E。乙醚和丙酮作為提取劑時，提取率較低，且提取物中不含維生素E或含有量較少。張獻忠等[12]研究了乙醚作為溶劑對煙葉中有效物質的提取效果，結果未發現提取物中含有維生素E，并發現乙醚對煙堿有一定的提取效果。環己烷作為提取劑，提取效率較高，煙堿、蒎烷、維生素E的收率均較高，且溶劑回收率較高。劉悍等[13]考察了乙醇和環己烷對煙葉中維生素E的提取效果，研究結果表明，2種溶劑對維生素E的提取效果相當。相比5種溶劑提取效果，選擇環己烷作為最佳提取劑。用環己烷得到的提取物中煙堿、蒎烷、維生素E所占提取物比例超過70%。

2.2　單因素實驗結果分析

當提取次數增至2次，提取率從6.50%上升至7.45%。當提取次數增至3次，提取率再次提升為7.59%，提升效果不明顯。為減少溶劑、能源消耗以及簡化提取工藝，選取2次為最適宜提取次數。

提取溫度對提取率的影響如圖3所示。為了避免熱敏性物質的損失，提取溫度區間選擇為30～70 ℃。圖3中所示，當溫度提升至40 ℃時，提取率迅速增加至最高，隨著溫度的進一步提升，提取率稍有下降并基本維持穩定。這是由于溫度提升加大了溶劑的分子運動[14-15]并增強了傳質速率所以導致提取率增加。但是過高的溫度會導致熱敏性物質的損失，最佳提取溫度必須同時考慮到能源消耗和提取率，因此選取35～45 ℃進行下一步研究。

圖3　提取溫度對提取率的影響Fig.3　Effect of temperature on the yield of the extract

物料細度對提取效率的影響如圖4所示。當物料細度由30目提升至50目時，提取率一直上升。這是由于物料越細，煙葉中溶質的溶解速度提升，同時固液兩相之間的有效接觸面增大使傳質速度加快提升了提取率。然而當物料目數增加至70目，由于物料過細導致吸附作用過強，降低了提取率。因此最適宜物料目數定為50目。

圖4　物料細度對提取率的影響Fig.4　Effect of particles size of powder on the yield of the extract

提取時間對提取率的影響如圖5所示，提取率隨提取時間增加而增加，并在6.0 h出達到最大值，隨后基本維持穩定。當提取時間達到6.0 h時，溶質與溶劑之間已達到溶解平衡，再增加提取時間并不能提升提取率。因此選取提取時間5.5～6.5 h進行下一步研究。

圖5　提取時間對提取率的影響Fig.5　Effect of extraction time on the yield of the extract

物料比對提取效率的影響如圖6所示。提取率隨物料比增加而增加，并在物料比增加至12以后基本維持穩定。這是由于當物料比為12時，煙葉中所含物質已達到最低水平，增加物料比已不能再有效提升提取率。因此，選擇物料比11～13進行下一步研究。

圖6　提取物料比對提取率的影響Fig.6　Effect of ratio of liquid to solid (mL/g) on the yield of the extract

2.3　提取參數的響應面優化

實驗設計以及結果如表3所示。經過Design-Expert軟件對數據進行二次多項式回歸，得模型如下。

Y=-159.4127+1.66019A+22.57298B+

10.49193C-0.051018AB-0.0062635AC-

0.35495BC-0.014908A2-1.33684B2-

0.33149C2

(3)

式(3)方差分析如表4所示。表4中可見，該模型P值為0.0014(<0.01)，R2=0.9435，失擬項(Lack of fit)值為0.0851(>0.05)不顯著，證明該模型擬合程度好，實驗誤差小，為可靠模型。在此模型中，A、C、A2、B2、C2為顯著項。與單因素實驗結果相吻合。

表3　Box-Behnken實驗設計及提取率響應值結果

2.3.1提取參數交互作用對提取率的影響

響應面圖可以很好的反映自變量之間的交互作用，并確定各個自變量的最大響應值[16]。各自變量的交互作用對提取率的影響如圖7、圖8和圖9所示。

提取時間和提取溫度的交互影響如圖7所示。從表3可以看出，提取溫度和時間的交互作用影響顯著(P<0.05)，并且二者對提取率影響均顯著。隨著提取溫度和時間的增加，提取率出現增加，但隨著繼續增加，提取率出現下降。這可能是由于熱敏性物質的損失以及提取劑提取性能隨著溫度變化而變化引起。

表4　回歸方程方差分析

Std. Dev.: 0.18;R2=0.9435;AdjR2=0.8709.aSignificant.bNot significant.

圖7　提取時間與溫度對提取率的影響Fig.7　Response surface plot for the effect of time-temperature on extraction

如圖8及表3所示，提取溫度對提取率的影響顯著(P<0.05)，然而物料比以及提取溫度和物料比的交互作用對提取率影響效果不顯著(P>0.05)。提取溫度和物料比對提取率的影響同提取溫度和時間對提取率的影響類似。

圖8　提取物料比與溫度對提取率的影響Fig.8　Response surface plot for the effect of liquid-solid ratio and temperature on extraction

提取時間及物料比交互作用對提取率的影響如圖9所示，提取物料比及時間的增長可以促進提取率的增加。但是過度的增加會導致提取率的降低。當提取物料比和時間超過一定值之后，煙葉內所含溶質處于可提取的最低水平。表3中方差分析可以證實二者交互作用對提取率影響不顯著(P>0.05)，同樣，物料比對提取率影響不顯著(P>0.05)，而提取時間顯著(P<0.05)。

圖9　提取時間與物料比對提取率的影響Fig.9　Response surface plot for the effect of time and liquid-solid ratio on extraction

2.3.2模型驗證

模型驗證試驗在提取溫度42.54 ℃、物料比12.31 mL/g、時間6.0 h下進行，所得收率為7.95%，與模型預測值7.94%相差無幾，表明此模型可靠。

3　結論

通過考察不同提取劑對提取率的影響，其中環己烷作提取劑有較高的提取率，且對煙堿、蒎烷、維生素E有較強的提取能力。選用環己烷作為提取劑，得到煙葉致香物質提取率較之前張獻忠[10]研究所得3.38%的提取率高出許多，并且所得致香物質中維生素E的含量較高。實驗證明提取時間、溫度、物料比對提取率有較大影響。通過響應面法對三因素進行提取工藝優化，所得最適宜提取工藝條件為：提取溫度42.54 ℃，物料比為12.31 mL/g，時間6.0 h，在此條件下可得收率7.95%。其中含煙堿為32.25%、蒎烷為23.14%、維生素E為14.11%。

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