糞大腸菌群及多管發(fā)酵法檢測(cè)探析

古麗茹合薩熱·艾海提

摘 要：隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，加強(qiáng)環(huán)境中各種細(xì)菌的檢驗(yàn)、掌握環(huán)境污染狀況，受到越來越多人的關(guān)注。糞大腸菌群檢測(cè)是水質(zhì)監(jiān)測(cè)的主要內(nèi)容之一，有助于環(huán)境評(píng)定及衛(wèi)生監(jiān)督工作的順利開展。該文對(duì)糞大腸菌群及多管發(fā)酵法檢測(cè)進(jìn)行探討，以供參考。

關(guān)鍵詞：糞大腸菌群 多管發(fā)酵法 檢測(cè) 探析

中圖分類號(hào)：X832 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2017）01（b）-0093-02

糞大腸菌群是評(píng)定水體受糞便污染程度的重要指標(biāo)，注重對(duì)其檢測(cè)在衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義。多管發(fā)酵是檢測(cè)糞大腸菌群的方法之一，對(duì)其進(jìn)行研究，有助于提高檢測(cè)結(jié)果精度，為其更好地推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 糞大腸菌群檢測(cè)價(jià)值

糞大腸菌群指在44.5 ℃溫度條件培養(yǎng)下，24 h能發(fā)酵產(chǎn)生乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。其主要生存在人與溫血?jiǎng)游锬c道中，與糞便一起排出體外，其數(shù)量直接反映水體受糞便污染程度。我國(guó)于1992年將糞大腸菌群檢測(cè)納入生活飲用水檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)，于2014年6月對(duì)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，將糞大腸菌群列為微生物檢測(cè)的強(qiáng)制檢測(cè)內(nèi)容。糞大腸菌群檢測(cè)價(jià)值體現(xiàn)在諸多方面，不僅為水體的評(píng)定提供參考，而且在衛(wèi)生監(jiān)督工作中發(fā)揮重要作用，有助于人們加強(qiáng)對(duì)糞便的管理，改善環(huán)境衛(wèi)生條件，為人們的生命健康提供保障。

2 多管發(fā)酵法檢測(cè)研究

2.1 培養(yǎng)基及試劑制備

檢測(cè)中使用的單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液制備方法為：分別取氯化鈉、乳糖、牛肉浸膏、蛋白胨各5 g、5 g、3 g、10 g加熱溶解在1 000 mL的蒸餾水中，將溶液的pH值調(diào)節(jié)為7.2～7.4，而后向其中加入1 mL 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝在試管中使用高壓滅菌器在115 ℃溫度條件下滅菌20 min，在冷暗處儲(chǔ)存，以備后用。配置3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的方法，與配置單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的方法相似，區(qū)別在于除蒸餾水外，將各組分的用量增加3倍。

EC培養(yǎng)液的配置方法為：使用5 g氯化鈉、1.5 g磷酸二氫鉀、4 g磷酸氫二鉀、1.5 g膽鹽三號(hào)、5 g乳糖、20 g胰胨，1 000 mL蒸餾水加熱溶解，分裝在含油玻璃導(dǎo)管的試管中。放置于高壓蒸汽滅菌器中將溫度調(diào)制115 ℃進(jìn)行20 min的滅菌處理，滅菌后將pH調(diào)為6.9。

為保證檢測(cè)結(jié)果存放培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意：處于密封瓶中的脫水培養(yǎng)基成品應(yīng)在溫度低于30 ℃、濕度低的暗處存放，尤其防止陽光直射。同時(shí)，還應(yīng)防止液體蒸發(fā)及雜菌侵入，當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液體積明顯改變，或顏色改變時(shí)應(yīng)禁止使用。

2.2 檢測(cè)步驟

（1）水樣接種量的確定。

充分混勻水樣，結(jié)合水樣污染程度，明確水樣接種量，尤其應(yīng)保證各樣品使用至少3個(gè)不同水樣量接種，保證同一接種水樣量有5管。未受污染水樣接種量取0.1 mL、1 mL、10 mL。依據(jù)污染程度受污染水樣接種量取0.01 mL、0.1 mL、1 mL。另外應(yīng)注意，當(dāng)接種體積為10 mL時(shí)，應(yīng)在試管中裝3倍濃度5 mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，當(dāng)接種量≤1 mL時(shí)可使用10 mL普通濃度的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液進(jìn)行接種。

（2）初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

在盛有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液發(fā)酵管中接種水樣，在（37±0.5）℃溫度條件下，培養(yǎng)（24±2）h。操作中應(yīng)注意，水樣加入前使用酒精燈消毒培養(yǎng)管管口，加入水樣后消毒封口。發(fā)酵24 h后觀察培養(yǎng)管，陽性判別的標(biāo)準(zhǔn)為培養(yǎng)管既產(chǎn)氣又產(chǎn)酸，即有氣泡產(chǎn)生且顏色由紫色變?yōu)辄S色為陽性。當(dāng)導(dǎo)管氣泡不夠明顯時(shí)，可用手輕拍，看是否有氣泡產(chǎn)生。

（3）復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

取判定為陽性的發(fā)酵管輕微振蕩，使用滅菌棒或3 mm接種環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到CE培養(yǎng)液中。在（44.5±0.5）℃溫度條件下培養(yǎng)（24±2）h。接種操作完成后在30 min內(nèi)將發(fā)酵管放進(jìn)水浴中。培養(yǎng)后及時(shí)進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)酵管產(chǎn)氣則可判定為糞大腸菌群陽性。

（4）結(jié)果計(jì)算。

根據(jù)不同接種量發(fā)酵管陽性結(jié)果數(shù)目，查閱相關(guān)表格得出每升水樣含有的糞大腸菌群。

3 多管發(fā)酵法質(zhì)量控制

使用多管發(fā)酵法檢測(cè)糞大腸菌群時(shí)，所受的影響因素較多，稍有不慎容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，因此，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性應(yīng)注重從人員技能、計(jì)量器、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、樣品均勻性等方面采取相關(guān)措施，做好質(zhì)量控制。

3.1 提高檢測(cè)人員水平

檢測(cè)中檢測(cè)人員不規(guī)范操作往往給檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生直接影響，因此，為避免檢測(cè)結(jié)果受檢測(cè)人員水平的影響，一方面，檢測(cè)作業(yè)前應(yīng)組織檢測(cè)人員加強(qiáng)檢測(cè)規(guī)范的學(xué)習(xí)，使其明確各檢測(cè)步驟及相關(guān)檢測(cè)參數(shù)。另一方面，做好檢測(cè)培訓(xùn)工作，講解檢測(cè)的方法與技巧，使參與檢測(cè)的人員明確檢測(cè)中的重點(diǎn)，尤其防止違規(guī)行為的出現(xiàn)。

3.2 保證實(shí)驗(yàn)設(shè)備質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)所用設(shè)備性能同樣會(huì)給檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，開展檢測(cè)工作時(shí)應(yīng)加強(qiáng)所用設(shè)備質(zhì)量的控制，尤其應(yīng)注意：首先，每天對(duì)恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行檢查，認(rèn)真記錄培養(yǎng)架使用區(qū)穩(wěn)定，確保其穩(wěn)定、準(zhǔn)確，溫度變化應(yīng)在±0.5 ℃內(nèi)；高壓蒸汽滅菌器應(yīng)能提供121 ℃的高壓滅菌溫度，使用運(yùn)行變色濾紙條對(duì)其滅菌結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，確保其處于最佳性能；另外，為保證所用儀器精度滿足檢測(cè)要求，儀器管理人員做好所用儀器的管理與維護(hù)，尤其要定期送到相關(guān)部門進(jìn)行校準(zhǔn)。

3.3 嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件

復(fù)發(fā)酵時(shí)應(yīng)注重將糞大腸菌群與自然環(huán)境大腸菌群加以區(qū)分，即接種后30 min內(nèi)應(yīng)將發(fā)酵管進(jìn)行水浴。否則適宜在44.5 ℃溫度生長(zhǎng)的糞大腸菌群會(huì)發(fā)酵產(chǎn)氣、產(chǎn)酸給檢測(cè)結(jié)果帶來干擾。同時(shí)，接種好的樣品應(yīng)在生化培養(yǎng)箱中的溫度達(dá)到（44.5±0.5）℃時(shí)才能放入。使用恒溫水浴箱時(shí)，應(yīng)保證水面高于接種物面。

3.4 確保培養(yǎng)基質(zhì)量

使用多管發(fā)酵法檢測(cè)糞大腸菌群時(shí)，為保證培養(yǎng)基質(zhì)量，應(yīng)注意以下內(nèi)容：為保證培養(yǎng)基的有效性，應(yīng)注重使用陰陽性菌株進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)，培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌、溶解操作后應(yīng)注重檢測(cè)其pH值，為細(xì)菌創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)條件；為防止細(xì)菌的迅速繁殖破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，培養(yǎng)基配置完成后應(yīng)及時(shí)分裝到試管中進(jìn)行滅菌處理；使用高壓滅菌器對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌后，氣壓降至0后，及時(shí)將培養(yǎng)基從滅菌器中取出，冷卻；考慮到內(nèi)置導(dǎo)管中可能存有氣泡，影響檢測(cè)結(jié)果，因此，使用前應(yīng)認(rèn)真檢測(cè)試管，禁止使用存有氣泡的培養(yǎng)基；配置完成的培養(yǎng)基存放時(shí)間不能太久，而且詳細(xì)注明配置的具體時(shí)間，針對(duì)已滅菌的培養(yǎng)基在4 ℃～10 ℃條件下可培養(yǎng)一周。另外，接種樣品前應(yīng)進(jìn)行充分搖勻，確保菌落處于分散狀態(tài)。

4 結(jié)語

隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，加強(qiáng)環(huán)境中各種細(xì)菌的檢驗(yàn)、掌握環(huán)境污染狀況，受到越來越多人的關(guān)注。糞大腸菌群是大腸菌群的一種，存于人與牲畜的糞便中，時(shí)常給水體造成污染，因此，加強(qiáng)對(duì)糞大腸菌群的檢驗(yàn)，不僅有助于了解水體受糞便的污染程度，而且對(duì)水體的治理具有重要參考。該文通過研究得出以下結(jié)論。

（1）糞大腸菌群檢驗(yàn)具有重要價(jià)值，尤其當(dāng)前水體污染嚴(yán)重的背景下，加強(qiáng)對(duì)其的檢驗(yàn)有助于改善水體環(huán)境，給人類的生產(chǎn)生活創(chuàng)造良好的環(huán)境，因此，國(guó)家不僅強(qiáng)調(diào)糞大腸菌群的檢驗(yàn)，而且制定相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，指導(dǎo)糞大腸菌群檢測(cè)工作。

（2）多管發(fā)酵法是糞大腸菌群檢測(cè)的常用方法，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求嚴(yán)格依據(jù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)試劑的配置，尤其應(yīng)分析影響檢測(cè)結(jié)果的因素，明確相關(guān)檢測(cè)環(huán)節(jié)注意事項(xiàng)，通過開展檢測(cè)前的培訓(xùn)工作，提高檢測(cè)人員的專業(yè)技術(shù)水平，確保其嚴(yán)格遵守相關(guān)規(guī)范要求開展檢測(cè)工作。

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