卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織的轉錄組比較分析

周 江王麗娟王 波鄭鳳榮王長海

(1. 南京農業大學資源與環境學院, 江蘇省海洋生物學重點實驗室, 南京 210095; 2. 中華人民共和國鹽城出入境檢驗檢疫局,鹽城 224002; 3. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 260061)

卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織的轉錄組比較分析

周 江1王麗娟2王 波3鄭鳳榮3王長海1

(1. 南京農業大學資源與環境學院, 江蘇省海洋生物學重點實驗室, 南京 210095; 2. 中華人民共和國鹽城出入境檢驗檢疫局,鹽城 224002; 3. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 260061)

為了解星斑川鰈(Starry Flounder, Platichthys stellatus)腦組織基因表達與卵巢發育調控的關系, 發掘相關功能基因, 研究提取卵巢成熟期和退化期星斑川鰈雌魚腦垂體和下丘腦組織總RNA, 運用HiSeq 2000高通量測序技術進行轉錄組測序分析。測序結果經拼接組裝后共獲得30640條Unigenes, Blast同源性比對顯示, 其中24128條Unigenes獲得注釋; 經eggNog功能注釋后29137條Unigenes序列分為26類, 分別涉及信號轉導、翻譯機制等生理生化過程。KEGG pathway數據比對顯示, 卵巢成熟期涉及98種代謝途徑, 135條序列表達上調; 卵巢退化期涉及192種代謝途徑, 648條序列表達上調。Unigenes表達量及表達差異分析表明在卵巢成熟期334條序列表達上調, 卵巢退化期987條序列表達上調。獲得功能注釋的Unigene中, 408條涉及生殖調控和內分泌調控, 參與生殖調控的信號分子有1508條。試驗采用實時定量 PCR研究了涉及生殖調控和內分泌調控基因促性腺激素釋放激素(GnRH)、神經激肽B(NKB)、促性腺激素(GtH)、促濾泡激素(FSH)、腫瘤轉移抑制因子(Kiss)以及催乳素釋放肽受體(PrRPR)在卵巢兩個不同發育時期腦垂體和下丘腦的表達情況, 結果表明除FSH外, 其余均在卵巢退化期時期腦組織中表達升高, 與轉錄組測序結果趨勢一致。

星斑川鰈; 腦組織; 轉錄組測序; 實時定量PCR

星斑川鰈(Starry Flounder, Platichthys stellatus)又稱星突江鰈, 隸屬鰈形目鰈科川鰈屬, 為廣鹽、冷水性種類, 在中國、朝鮮、韓國、日本、俄羅斯及美國太平洋沿岸海域均有分布, 具有廣溫廣鹽、耐受性強、易于馴化和營養豐富等特點, 是理想的集約化養殖對象[1]。近年來, 雖然星斑川鰈人工繁育技術有所突破[2], 但對于其卵巢發育的調控機制卻了解不多。目前, 國內外有關星斑川鰈的研究報道多集中在其生長[3], 生物學地位[4,5]、生態分布以及營養價值[1]等方面, 少數學者的研究涉及了星斑川鰈的種群遺傳結構和生理、生化等方面[6—8], 我國于2004年開始對星斑川鰈親魚培育技術進行研究[9]之后相繼對人工育苗和工廠化養殖技術[10,11]、胚胎發育[12]、幼魚形態發育與生長[13]進行了研究,對于星斑川鰈繁殖相關分子機制研究還未見報道。由于魚類配子發生和性腺成熟是通過神經內分泌系統經由腦-垂體-性腺軸調控得以實現, 其結果表現為性腺發育周期性變化, 下丘腦分泌促性腺激素釋放激素, 垂體隨后分泌促性腺激素, 性腺接受調控分泌相應的性激素和孕激素, 隨后性腺發育,成熟后進入生殖階段, 完成繁殖后即退化。繁殖和退化過程的完成經過了許多結構和功能的轉變, 了解調控這些轉變的因子是研究星斑川鰈人工繁殖的關鍵。

對魚類卵巢發育的調控及影響的早期研究多從內分泌角度出發, 但轉錄組學分析技術的應用為研究硬骨魚類卵巢發育及排卵的分子調控機制提供了新的工具[14,15]。迄今為止, 有關卵巢發育轉錄表達的研究工作較多地集中在模式魚類, 如斑馬魚(Danio rerio)、鰷(Pimephales promelas)[16,17], 盡管近期在養殖魚類, 如花條鱸(Morone saxatilis)、橄欖比目魚(Paralichthys olivaceus)等也有關于卵巢轉錄組研究報道, 但這些研究或者采用的定量效率較弱：如基因芯片技術、抑或是各期卵巢的混合樣品, 其關注的依然是卵巢器官特異基因表達的特性分析, 而非對不同成熟期的卵巢轉錄特征進行分析[18, 19]。

轉錄組測序技術可以獲得特定細胞在某一狀態下所能轉錄出來的所有RNA, 包括非編碼RNA和信使RNA (mRNA), 可高通量地獲得基因表達的RNA水平有關信息, 通過獲得研究對象基因組轉錄區域的信息, 鑒定轉錄發生位點, 可變剪切等, 可對基因進行精確的定量分析[20—22]。目前, 轉錄組測序技術已逐步取代基因芯片技術, 成為從全基因組水平研究基因表達的主流方法。為了詳細了解星斑川鰈的繁殖機理和遺傳特點, 本研究借助高通量測序技術對卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織進行了分析, 為今后我國星斑川鰈人工繁殖技術水平提高以及雜交育種和品種改良研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及總RNA提取

試驗用星斑川鰈取自日照海洋水產資源增殖站, 隨機取樣卵巢成熟期和退化期健康星斑川鰈3齡雌性親魚各10尾(1053.6±42.5) g, 分別取腦垂體和下丘腦組織后迅速投入液氮轉入-80℃保存待用?？俁NA提取方法參照Trizol Reagent (Invitrogen)說明書進行, 以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢驗總RNA質量。

1.2 樣品前處理及測序

將卵巢成熟期和退化期親魚腦垂體和下丘腦組織RNA檢測濃度和純度后, 各選取5條質量最佳的親魚RNA作為混合測序樣品。根據測得的RNA濃度, 將符合要求的RNA樣品等量混合至新離心管中, 再次檢測混合后RNA樣品的濃度和純度。混合后RNA樣品置于1.5 mL離心管中送上海派森諾公司測序。

將提取的卵巢成熟期和退化期的星斑川鰈腦垂體和下丘腦總RNA用帶有Oligo (dt)的磁珠富集mRNA, 由反轉錄酶和隨機引物將片段化的mRNA合成cDNA第一鏈, 第二鏈合成使用緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ, 經核酸外切酶和聚合酶進行末端修復, 連接接頭, 分離純化, 擴增DNA文庫。采用Picogreen和熒光分光光度計定量文庫, Agilent 2100控制PCR富集片段質量, 驗證DNA文庫質量, 樣品稀釋至4—5 pmol/L后上機測序。

利用HiSeq 2000平臺獲得星斑川鰈卵巢成熟期和退化期腦垂體和下丘腦組織圖像序列信息, 然后轉化為相應核苷酸序列, 進行可信度分析及質量評估。去除低質量序列, 運用Velvet和Oases軟件進行組裝拼接, blast聚類得到Unigene(http://www.ebi.ac. uk/～zerbino/velvet; http://www.ebi.ac.uk/～zerbino/ oases)[23,24]。

1.3 序列比對、eggNOG功能注釋、KEGG代謝通路分析及表達差異分析

將所得序列與SwissProt、nr、Non Redudant數據庫進行序列比對, 統計與數據庫中已收錄基因具有高度相似性的序列, 獲取最佳注釋(E-value＜10-5); 將所有序列在eggNOG數據庫中進行比對(E-value＜10-5), 獲得表達序列的NOG功能注釋及分類,收集建立基因同源組群, 包括COG和KOG數據(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG; http://eggnog. embl.de/)[25]。

使用RPKM值(Reads per kb per million reads),計算基因表達量, 2-fold法統計成熟期和退化期序列RPKM值差異(定義: 一條序列的RPKM值在成熟期大于或等于退化期的2倍, 則為成熟期表達上調,反之則為退化期表達上調。若兩時期RPKM值差異不超過2倍, 則為表達無差異) 。全部序列在KEGG pathway數據庫中進行比對, 獲得相關序列代謝通路注釋及在代謝通路中的具體位置信息(http://www. genome.jp/kegg/)[26,27]。

1.4 GnRH、NKB、GtH、Kiss、FSH及PrRPR在不同卵巢發育時期實時定量PCR分析

為驗證RNA測序結果, 將進行轉錄組測序時提取的卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織總RNA各取3個樣本, 使用Prime ScriptTMII 1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)反轉錄得到cDNA。按照Real-time PCR說明書FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)進行Real-time PCR反應, 所用引物如表 1, 目的基因Ct值取3個平行均值, 管家基因β-actin為內參, 目的基因Ct值與內參基因的Ct值之間差異稱為ΔΔCt, 2-ΔΔCt值即為樣品的該基因的相對表達水平[28], 設成熟期為對照,即成熟期樣品的值均設為1倍, PCR反應條件為: 95℃, 10min; 95℃, 15s; 60℃, 60s; 72℃, 1min, 40個循環。

2 結果

2.1 序列注釋及分析

拼接組裝得到的30640條Unigenes經Blast同源比對NCBI數據庫, 其中24128條獲得同源序列注釋,占總數的78.75% (E-value＜10-5)。將全部Unigenes進行eggNOG注釋后, 歸入適當的eggNOG簇。在功能已知的29137條Unigenes中, 按功能不同將其分為26大類, 其中涉及信號轉導機制的Unigenes所占比例最大, 為21.20%, 其次是涉及基本功能和轉錄機制的Unigenes各占9.29%和8.84% (圖 1)。利用RPKA值差異顯著性(P＜0.05)計算兩個卵巢發育時期基因表達量, 并用2-fold法進行數據統計分析差異表達基因分析（圖 2）。在獲得的轉錄組序列數據中, 成熟期表達上調的序列有334條, 退化期表達上調的序列有987條。

表 1 實時定量PCR引物序列Tab. 1 Sequences of Real-time PCR primers

2.2 差異表達unigene的GO富集分析

在兩期表達上調的1321條Unigenes與GO數據庫進行比對的結果顯示如圖 3所示, 三大功能分類分別包含了6、9和37個功能分類。在細胞組分分組中, 兩時期腦組織差異表達基因在細胞、細胞內和細胞組分類型比例最高, 分別為22.60%、19.21%、19.21%和21.69%、18.81%和17.08%。在分子功能分組中, 兩時期腦組織差異表達基因在分子功能、離子結合所占比例較高, 為50.43%、27.35%和44.95%和29.62%。在生物學過程分組中, 兩時期腦組織差異表達基因在生物學過程、生物合成過程和細胞氮代謝過程所占比例較高, 分別為16.13%、8.06%、7.66%和17.69%、7.85%和6.62%。差異表達基因的GO功能富集分析表明, 在星斑川鰈卵巢發育過程中, 蛋白質等營養物質的積累, 包括鈣磷等微量元素在體內的變化以及因此導致的胞內胞外一系列信號應答機制和相關激素的合成、釋放、調控生殖發育作用為此期間主要的神經內分泌行為。

圖 1 Unigenes eggNOG功能分類Fig. 1 eggNOG function classification of unigenesA. RNA加工與修飾RNA processing and modification; B. 染色質結構與變化Chromatin structure and dynamics; C. 能量產生與轉化Energy production and conversion; D. 細胞周期調控與分裂,染色體重排Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E. 氨基酸運輸與代謝Amino acid transport andmetabolism; F. 核苷酸運輸與代謝Nucleotide transport and metabolism; G. 碳水化合物運輸與代謝Carbohydrate transport and metabolism; H. 輔酶運輸與代謝Coenzyme transport and metabolism; I. 脂類運輸與代謝Lipid transport and metabolism; J.翻譯, 核糖體結構與生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis; K. 轉錄Transcription; L. 復制、重組與修復Replication, recombination and repair; M. 胞壁/膜生物發生Cell wall/memberance/envelope biogenesis; N. 細胞運動Cell motility; O. 蛋白質翻譯后修飾與轉運, 分子伴侶Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. 無機離子運輸與代謝Inorganic ion transport and metabolism; Q. 次生產物合成, 運輸及代謝Secondary metabolites biosynthesis, transport andcatabolism; R. 一般功能基因General function prediction only; S. 功能未知Function unknown; T. 信號傳導機制Signal transduction mechanisms; U. 胞內分泌與膜泡運輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V. 防御機制Defense mechanisms; W. 細胞外結構Extracellular; X. 未確定Undetermined; Y.核酸結構Nuclear structure; Z. 細胞骨架Cytoskeleton

2.3 KEGG pathway注釋及富集分析

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫記錄細胞中基因產物的功能以及基因產物的相互作用網絡, 基于KEGG通路的分析有助于我們進一步了解基因的生物學功能以及所有可能的代謝途徑, 而且可以對催化各步反應的酶進行全面的注解。對全部序列進行KEGG代謝通路數據庫比對和注釋, 結果表明成熟期涉及98種代謝途徑, 表達上調的序列有135條; 退化期涉及192種代謝途徑, 表達上調的序列有648條(圖 4)。結合差異表達基因的KEGG功能注釋結果, 進行Pathway顯著性富集分析。共得到顯著富集的Pathway包括免疫系統、神經系統、信號分子相互作用、信號轉導、內分泌系統、細胞通訊等代謝通路。此外,一些參與生殖、生長和發育的功能基因分入卵母細胞減數分裂(Oocyte meiosis)和促性腺激素釋放激素信號通路(GnRH signaling pathway)(表 2)。通過對注釋結果進一步統計分析, 查找到與生殖發育調控以及內分泌相關的基因有408條, 不同分類的生殖發育調控以及內分泌相關的基因及數目如表3所示。參與生殖調控與內分泌相關的信號分子及基因數目主要有鈣調蛋白98條、磷酸酯酶534條、蛋白激酶798條及環腺苷酸 87條, 共計1508條。

圖 2 卵巢發育不同時期序列表達差異Fig. 2 Unigenes different expression in different ovary deve-lopment stages

2.4 GnRH、NKB、GtH、Kiss、FSH及Pr-RPR在不同卵巢發育時期的腦組織中的表達驗證

圖 5所示, 生長激素釋放激素GnRH、促性腺激素GtH、促濾泡激素FSH、PrRPR、神經激肽BneurokininB及Kisspeptin基因在卵巢不同發育時期的表達不同, GnRH、NKB、GtH、Kis和PrRPR在卵巢退化期的表達水平高, PrRPR的表達水平在退化期超過了成熟期的5倍, 而FSH則在卵巢成熟期的表達水平較高, 與轉錄組測序結果趨勢一致, 盡管表達量存在一定差異。

3 討論

目前, RNA測序技術在魚類的研究中已經發揮了重要作用, 郭威[29]利用該技術進行了黃鱔腦及性腺轉錄組分析及差異基因篩選, 發現在3種不同性腺發育時期黃鱔間, 差異表達基因多集中在性腺中;程云英[30]對6月齡奧里亞羅非魚雌雄性腺經行了轉錄組測序, 發現二者中大部分基因表達模式相一致; Zucchi等[31]使用微陣列雜交的方法研究了雌性斑馬魚孕酮誘導后腦和卵巢中基因變化情況。星斑川鰈為我國新興的經濟海水魚類, 具有重要的經濟價值, 但該魚分子遺傳基礎研究較為薄弱, 基因組序列信息缺乏, 本研究采用HiSeq 2000高通量測序技術對卵巢發育不同時期的星斑川鰈的腦組織進行測序分析, 有望充實星斑川鰈的公共EST數據資源, 挖掘更多具有潛在價值的基因并更好地理解星斑川鰈生殖和發育的分子生物學機制。

3.1 卵巢差異表達基因的分析

本次測序共獲得30640條Unigenes, 24128Uni-genes能獲得生物信息學注釋。其中408條與生殖調控相關, 而參與生殖調控的信號分子則有1508條。Unigenes的KEGG pathway數據比對分析,卵巢成熟期涉及98種代謝途徑, 表達上調的序列有135條; 卵巢退化期涉及192種代謝途徑, 表達上調的序列有648條。Unigenes表達量及表達差異分析表明在卵巢成熟期基因表達上調的334條Unigenes,在卵巢退化期表達上調987條Unigenes。

圖 3 Unigenes的GO分類Fig. 3 GO classification of unigenes

圖 4 KEGG信號通路中的unigenes數量分布Fig. 4 The distribution of unigenes in KEGG pathway

表 2 星斑川鰈卵巢發育相關基因Tab. 2 The Genes involved in ovary development of Platichthys stellatus

表 3 生殖調控相關的基因Tab. 3 The genes involved in procreation regulation

圖 5 GnRH、FSH、NKB、GtH、Kis、PrRPR在卵巢成熟期和退化期腦組織中的表達Fig. 5 The expression of GnRH, NKB, FSH, GtH, Kiss and PrRPR during the stage of ovary maturation and stage of ovary degeneration

星斑川鰈的卵巢發育是屬于非同步型, 繁殖期分批成熟多次產卵, 即卵巢內含有至少兩種處于不同發育階段的卵母細胞群, 在第一次排卵結束后卵巢中還存留相當部分的待成熟卵母細胞。據本研究結果顯示, 在第一次排卵前, 差異表達基因中包括促進葡萄糖轉運蛋白、蛋白磷酸酶、微管蛋白、過氧化物酶、果糖-二磷酸醛縮酶、谷氨酰轉肽酶、鐵傳遞蛋白、二氫蝶啶還原酶等基因, 涉及的信號通路包括蛋白質、脂肪代謝、鈣磷代謝, 而有關促性腺激素釋放激素、促性腺激素的調控基因等只是常態表達, 這說明了在此期間, 卵巢發育需要大量營養物質及微量元素的支持而相關的性激素只是緩慢平穩的上升; 排卵行為產生是以促性腺激素分泌到峰值為先導, 與此相對應, 在本研究中,星斑川鰈雌魚排卵過程中差異表達基因包括促性腺激素釋放激素受體、神經肽Y、胰島素樣生長因子、電壓門控鈣離子通道、孕激素受體等一批配合排卵過程調控的基因表達都變為上調狀態, 據對金魚、鯉等的研究表明, 促性腺激素釋放激素刺激促性腺激素釋放依賴于細胞外鈣離子的有效性, 白細胞介素等免疫因子參與排卵過程的調控[32—35]。

采用實時定量PCR的方法對與生殖調控相關的基因進一步的研究發現, FSH基因在星斑川鰈性腺成熟期時的腦組織中表達較高, 而GtH、PrRPR、NKB、GnRH以及Kiss則在退化期的表達水平較高。Levavi等[36]在鮭科魚中的研究表明, FSH主要在性腺發育早期起調控作用, 并不參與排卵的調控,而LH主要參與配子成熟和排出, Rocha等[37]在舌齒鱸中的研究發現, FSHR強烈表達于卵黃生成期和早期卵黃生成階段, 但并不表達于成熟卵細胞, 真鯛(Pagrus major) LHβ轉錄本在兩性配子發生到排出始終保持較高水平[38]。這些結果表明GtHs在硬骨魚生殖調控中的功能存在一定的種屬特異性。

3.2 與卵巢發育相關的信號通路

從本次轉錄組測序中, 胰島素樣生長因子(IGF1)、表皮生長因子受體(EGFR)、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin Dependent Kinase, CDK)、細胞分裂周期因子(cell division cycle, cdc)、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase)、細胞外信號調節激酶1/2 (ERK1/2)等一系列關鍵酶和受體調節因子蛋白激酶A (PKA)都被發現。其中細胞外信號調節激酶(Extra-cellular signal-regulated kinase, ERK)信號通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38)信號通路、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)信號通路和細胞外信號調節激酶5 (extracellular-regulated kinase 5, ERK5)信號通路[39]是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導途徑的子通路, 各子途徑相互交錯聯系并作用, 形成一個巨大的信息傳遞網。據研究, MAPK信號通路在海星(Asterina miniata)卵母細胞減數分裂過程發揮重要作用, 即MAPK途徑維持卵母細胞減數分裂MI期的穩定, 但也人有認為MI期停滯與MAPK途徑無關, 但MAPK會影響排卵后的MI期的長短[40]。Roux等[41]發現MAPK通路會影響紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)精子和卵子的結合, 由此可見, MAPK信號通路對卵子發生、精子形成和性腺發育都有著顯著的功能。

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COMPARISON ANALYSIS ON TRANSCRIPTOME IN THE PITUITARY GLAND AND HYPOTHALAMUS OF STARRY FLOUNDER (PLATICHTHYS STELLATUS) AT THE OVARY MATURATION AND DEGRADATION STAGES

ZHOU Jiang1, WANG Li-Juan2, WANG Bo3, ZHENG Feng-Rong3and WANG Chang-Hai1
(1. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology, College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Yancheng Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of the People’s Republic of China, Yancheng 224002, China; 3. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 260061, China)

To investigate the relationship of genes expression between brain tissue and ovary development, and explore more functional genes of Platichthys stellatus, total RNA from the mixed sample of pituitary gland and hypothalamus at the ovary maturation and degradation stages were isolated and sequenced by HiSeq 2000 high throughput sequencing technology. After assembly and splicing, 24128 unigenes from a total of 30640 unigenes were annotated based on the blast homology alignment. All 29137 unigenes with eggNog annotations were divided into 26 categories that were involved in physiological processes, such as signaling transduction, translation mechanism, etc. The results from KEGG pathway analysis showed that all unigenes at the ovary maturation stage were involved in metabolic pathways with 135 up-regulated sequences, while the unigenes at the ovary degradation stage were associated with 192 metabolic pathways with 648 up-regulated sequences. Moreover, 334 differentially expressed genes (DEGs) were up-regulated at the ovary maturation stage, while 987 up-regulated DEGs were observed at the ovary degradation stage. Total 408 unigenes were involved in reproductive and endocrine regulation, and 1508 unigenes were involved in signaling molecules. The expression of some reproduction-associated DEGs including growth hormone releasing hormone (GnRH), neurokinin B (NKB), gonadotropin (GtH), follicle stimulating hormone (FSH), kisspeptin (Kiss), and prolactin-releasing peptide receptor (PrRPR) were verified by qRT-PCR. All genes except FSH were consistent with the results of the transcriptome sequencing.

Platichthys stellatus; Brain tissue; Transcriptome sequencing; qRT-PCR

S961.6

A

1000-3207(2017)02-0346-10

10.7541/2017.42

2016-05-26;

2016-07-11

國家高技術發展計劃“863項目”(2012AA10A413、2012AA10A408); 國家海洋公益性行業科研專項(201305005)資助[Supported by the National High-tech R&D Program “863 Program” (2012AA10A413, 2012AA10A408); Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201305005)]

周江(1979—), 男, 湖北荊州人; 博士研究生; 主要從事海洋生物學研究。E-mail: zhoujiang768@126.com

王長海(1962—), 男, 山東煙臺人; 教授、博士生導師; 主要從事海洋生化工程研究。E-mail: chwang@njau.edu.cn