雜交鲇惡臭假單胞菌的分離鑒定及其病理損傷研究

段亞佼黃小麗詹瑰然樊 威段 靖趙一璘鄧永強耿 毅陳德芳汪開毓

(1. 四川農業大學動物科技學院水產系, 成都 611130; 2. 云南省會澤縣水產工作站, 曲靖 654200; 3. 四川省內江市農業科學院,內江 641000; 4. 四川省動物疫病預防控制中心, 成都 610041; 5. 四川農業大學動物醫學院, 成都 611130)

雜交鲇惡臭假單胞菌的分離鑒定及其病理損傷研究

段亞佼1黃小麗1詹瑰然2樊 威3段 靖1趙一璘1鄧永強4耿 毅5陳德芳1汪開毓5

(1. 四川農業大學動物科技學院水產系, 成都 611130; 2. 云南省會澤縣水產工作站, 曲靖 654200; 3. 四川省內江市農業科學院,內江 641000; 4. 四川省動物疫病預防控制中心, 成都 610041; 5. 四川農業大學動物醫學院, 成都 611130)

為確定一起雜交鲇皮膚潰瘍癥的病原, 實驗從病魚體內分離到幾株優勢菌(DYJ140914-DYJ140917), 根據4株分離菌的形態、生理生化特性, 結合16S rRNA和gyrB基因序列測定(GenBank登錄號分別為KP693689和KP693690)與系統發育分析, 將其鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。在此基礎上以腹腔注射的方式進行人工感染試驗, 證實其為雜交鲇潰瘍癥的病原菌。病魚組織器官具有典型的病理變化, 其主要靶器官為肝臟、皮膚肌肉以及腎間質, 分別引起多灶性壞死性肝炎、壞死性肌炎及壞死性間質性腎炎。此外, 還可引起心外膜、心內膜炎及壞死性脾炎。藥敏結果顯示該菌對強力霉素、諾氟沙星和左氧氟沙星等藥物敏感; 對青霉素、氟苯尼考、磺胺甲基異惡唑、頭孢西丁、阿奇霉素等藥物耐藥。

雜交鲇; 惡臭假單胞菌; 16S rRNA; gyrB; 病理損傷

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)為一種革蘭氏陰性、需氧短桿菌, 隸屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌屬(Pseudomonas), 是一種具有腐化作用的細菌, 常常存在于含氧的土壤及水環境中[1], 多為葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征[2]、敗血癥[3]、化膿性中耳炎, 角膜鞏膜炎和由食物中毒導致的痢疾樣腹瀉等[4]人類感染性疾病的病原體。該菌極易感染粒細胞缺乏癌患者[5,6]和新生兒[2]等免疫功能低下者, 并且還可以引起眼部及耳部感染、傷口感染等[7,8]。研究表明, 惡臭假單胞菌不僅可引起人類臨床感染, 而且也可引起水生動物感染發病。可導致香魚(Plecoglossus altivelis)、黃鰭短須石首魚(Umbrina roncador)、(Seriola quinqueradiata)[9]、大黃魚(Larimichthys crocea)、大鯢(Andrias davidianus)大規模死亡[10,11], 也可引起黑鯛(Sparus macrocephlus)腸胃炎[12], 歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)爛鰓病[13], 羅氏沼蝦(Macrobra'chiumrosenbergiideman)黃鰓、黑鰓病[14], 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)皮膚嚴重潰瘍[15]等。

雜交鲇(Hybrid catfish)是國內近年興起的養殖品種, 是由南方大口鲇(Silurus soldatovi meridionalis Chen, ♂)和本地鲇(Silurus asotus Linnaeus, ♀)雜交而成, 雜交優勢明顯[16], 既具有大口鲇父本固有的個體大、生長快、攝食力強和肉味鮮美的特點, 又具有鲇母本固有的性情較溫和、同類相殘力較弱、養殖成活率較高的特點[17]。因其肉質鮮美, 嫩滑少刺而備受廣大消費者青睞。但隨著養殖規模的不斷擴大, 雜交鲇的病害問題日漸突出, 已經嚴重影響了雜交鲇養殖產業的健康發展[18]。

2014年9月, 四川省眉山某養殖場養殖的雜交鲇出現了以皮膚褪色、潰爛為主要特征的疾病, 發病率達到85%以上, 死亡率達70%以上。為明確該病病原, 本研究從患病雜交鲇中分離出一株高致病性病原菌, 采用常規生理生化鑒定結合病理學診斷進行初步鑒定, 對16S rRNA、gyrB基因進行測序并構建系統發育樹, 對該菌做進一步鑒定, 最終確診為惡臭假單胞菌感染, 同時檢測了藥物敏感性, 旨在為雜交鲇潰瘍病的正確診斷以及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物具有典型患病癥狀的雜交鲇15尾, 取自四川眉山雜交鲇養殖場, 體長26—30 cm,用于剖檢觀察、病料采集和病原菌分離; 健康雜交鲇120尾(體長20—25 cm), 取自四川農業大學水產養殖實驗基地, 用于回歸實驗。

主要試劑腦心浸液培養基(BHI)、水解酪蛋白瓊脂培養基(MH)、大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)、細菌生化微量鑒定管及抗生素藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司; 細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen); PCR擴增試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 尸檢

將患病雜交鲇用MS222麻醉后剖解, 依次觀察腹腔、胸腔、圍心腔內各內臟器官黏膜及大體病變情況。將鰓絲、消化道內容物、體表黏液等置于載玻片上壓片鏡檢; 同時取腎臟于潔凈載玻片上制作組織觸片, 風干后進行diff-quick染色, 油鏡檢查。

1.3 病原菌分離

取具有典型癥狀的病魚, 用無菌生理鹽水對病魚的體表進行沖洗, 然后用滅菌剪刀打開腹腔, 無菌環境下從腎和脾取樣, 于BHI平板上劃線, 28℃培養24—48h, 觀察細菌生長狀況。挑取形態一致的優勢菌落進一步劃線純化, 獲得細菌純培養菌株, 4℃保存備用。

1.4 分離菌生理生化鑒定

用BHI培養基, 28℃培養病原菌18—24h, 對細菌進行革蘭氏染色, 在顯微鏡下觀察; 用接種針接種到細菌生化反應微量鑒定管中, 28℃恒溫培養24h, 按照《常見細菌系統鑒定手冊》[19]的方法進行主要理化特性檢測。

1.5 16S rRNA及gyrB基因序列測定和分析

病原菌DNA提取取對數生長期的新鮮菌液, 離心收集菌體, 使用細菌基因組DNA提取試劑盒對病原菌基因組DNA進行提取。

PCR擴增與測序及系統發育分析采用16S rRNA的通用引物[20](上游引物: 5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′, 下游引物: 5′-GGCTACCT TGTTACGACTT-3′)和gyrB基因通用引物[21](上游引物: 5′-GAAGGCGGNACNCAYGAAG-3′, 下游引物: 5′-CTTCRTGNGTNCCGCCTTC-3′)(Y代表C/T, R代表A/G, N代表A、T、C或G)分別進行PCR擴增, PCR反應條件為: 94℃ 5min; 94℃ 1min, 54℃ 1min, 72℃ 2min, 30個循環; 72℃ 10min。反應結束后取5 μL PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。預期擴增片段大小分別約為1500與1200 bp。PCR產物經電泳檢測為預期目的條帶后進行純化,然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa)并轉化到DH5α感受態大腸桿菌中, 送北京六合華大基因科技股份有限公司測定核苷酸序列。將病原菌的16S rRNA和gryB基因序列和已知GenBank數據庫中的核酸序列進行Blast比對, 同時保存同屬菌株的16S rRNA及gyrB序列信息, 利用MEGA 4.1和DNA Star 5.0軟件進行序列同源性分析, 并用Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1.6 分離菌回歸感染實驗

將菌株接種于BHI肉湯, 28℃搖床培養24h, 用麥氏比濁管將菌液濃度調至3.4×108、3.4×107、3.4×106、3.4×105和3.4×104CFU/mL, 分別經腹腔注射健康的雜交鲇, 注射劑量0.1 mL/尾, 20尾/組。另選20尾魚每尾注射0.1 mL 0.65%無菌生理鹽水作為對照組。每天正常喂養、通氣換水, 并把實驗組水溫控制在(20±1)℃, 詳細觀察魚的臨床表現并統計死亡情況, 連續觀察7d。

1.7 藥敏試驗

采用瓊脂擴散法(K-B法)測定分離菌株對11種抗菌素的藥物敏感性。無菌環境下將菌接種在BHI肉湯中, 用麥氏比濁管調菌液濃度至1.5×108CFU/ m,然后將稀釋后的菌液涂布于BHI平板上, 貼上藥敏紙片, 28℃培養24h后, 測定抑菌圈直徑并判定結果, 敏感度根據杭州天和微生物試劑有限公司提供的標準進行判定。

1.8 組織病理損傷觀察

取患病癥狀明顯雜交鲇的皮膚肌肉、腦、心臟、鰓、腎、肝、脾、胃腸道等內臟器官組織, 用10%的中性緩沖福爾馬林固定液固定, 酒精梯度脫水,二甲苯透明, 石蠟包埋、切片, 蘇木精-伊紅(HE)染色, 中性樹脂膠封片后, 顯微鏡觀察、拍照。

2 結果

2.1 尸檢

患病雜交鲇魚體體表大面積多處褪色, 出現典型潰瘍灶; 眼睛周圍皮膚出血褪色, 嚴重潰瘍(圖1A); 魚體背部皮膚發白嚴重, 大面積深度潰爛(圖1B); 尾部出現潰瘍灶, 尾鰭潰爛(圖 1C); 剖解后觀察到肝臟腫大, 邊緣光滑, 質硬; 脾臟邊緣鈍圓, 腫大。腎臟組織觸片diff-quick染色可見細胞間隙中存在多量桿狀細菌, 未觀察到寄生蟲(圖 1D)。

圖 1 雜交鲇感染惡臭假單胞菌的主要剖解癥狀及腎臟觸片觀察Fig. 1 Major anatomy symptoms and kidney imprint of Pseudomonas putida infected with hybrid catfishA. 眼周潰瘍灶(★); B. 背部肌肉深度潰瘍(★), 出血; C. 尾鰭潰爛(★); D.腎臟觸片可見短桿菌(→)A. Ulceration of the skin around the eyes (★); B. Ulceration and discoloration of the dorsum skin (★); C. Caudal fin rot (★); D. Some bacterias and inflammatory cells in the Intercellular (→)

2.2 病原菌的分離純化與形態學特性

從患病15尾雜交鲇腎和脾中均分離獲得大量細菌, 其菌落形態基本一致, 在BHI平板上, 28℃培養24h后, 形成邊緣整齊, 濕潤, 呈圓形, 中央隆起,直徑1—2 mm淡黃色半透明的圓形菌落, 革蘭氏染色結果顯示為陰性, 短桿狀。選擇形態一致, 純度較高的優勢菌保種備用, 共獲得4株分離菌, 分別命名為: DYJ140914、DYJ140915、DYJ140916、DYJ140917。

2.3 生化鑒定結果

結果表明, 4株分離菌的主要生化特性一致(表1), 根據其生長特性及生理生化特征, 初步判定為惡臭假單胞菌(P. putida)。

2.4 16S rRNA和gyrB基因序列測定結果和系統發育分析

由于4株菌的主要生理生化特性完全一致, 故選擇其中一株菌(編號為DYJ140914)進行16S rRNA和gyrB基因測序, 利用PCR技術擴增出16S rRNA和 gyrB基因片段, 產物經瓊脂糖電泳檢測, 結果顯示該片段大小約為1427和1149 bp, 與預期相符。GenBank登錄號分別為KP693689和KP693690, 測序結果表明該產物序列與GenBank數據中心上的惡臭假單胞菌P. putida的同源性最高, 在以分離菌16S rRNA和gyrB序列及其GenBank中同源性較高的惡臭假單胞菌屬細菌16S rRNA及gyrB序列構建的系統發育樹上(圖 2), 分離菌與惡臭假單胞菌聚為一族, 與來源與其他水生動物的惡臭假單胞菌同源性達99.2%以上。

2.5 人工感染試驗

在分離菌株經人工感染后, 對雜交鲇有較強致病力。接種感染8h后, 雜交鲇呼吸頻率加快, 游動緩慢無力, 在水中呈垂懸姿勢游動, 隨病情發展, 部分雜交鲇體表出現不同程度的皮膚發白、糜爛。

菌液濃度3.4×108CFU/mL組雜交鲇第2天出現死亡, 在感染6d內死亡率達85%; 3.4×107CFU/mL組第2天開始死亡, 死亡率60%; 3.4×106CFU/mL組第3天開始死亡, 死亡率45%; 對照組雜交鲇在觀察期內均表現正常, 無死亡情況(表 2)。對人工感染發病的雜交鲇進行細菌學分離檢測, 獲得與分離菌株DYJ140914形態及理化特征相同的細菌。

表 1 分離菌的生化特性Tab. 1 Biochemical characteristics of the isolated strain

2.6 藥敏性檢測

由表 3可知, 分離菌對強力霉素、諾氟沙星和左氧氟沙星敏感, 對新霉素中度敏感, 對氨芐青霉素、青霉素、氟苯尼考、磺胺甲基異惡唑、頭孢西丁、阿奇霉素、利福平耐藥。

2.7 組織病理損傷

圖 2 菌株DYJ140914的16S rRNA基因序列(A)、gyrB基因序列(B)及相關菌株構建的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic trees were generated using MEGA5.0 based on alignment for 16S rRNA (A) and gyrB gene (B) sequence of the isolate strain DYJ140914 and other related species in Pseudomonas genus

惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)感染雜交鲇造成的病理損傷主要集中在肝、皮膚肌肉、腎、脾和心臟。其中主要以肝臟、皮膚肌肉、腎間質的病變最為明顯。肝臟出現多灶性壞死(圖3A), 壞死灶內細胞濃縮, 胞核碎裂甚至消失, 崩解的組織間隙內存在較多桿狀菌(圖 3B); 皮膚表皮壞死脫落(圖 3C), 肌纖維和肌漿凝固, 呈蜂窩狀, 炎癥細胞浸潤, 肌纖維內及肌纖維間可見大量桿狀菌(圖 3D); 腎間質多灶性壞死(圖 3E), 間質內大量中性白細胞浸潤, 大量紅細胞積聚, 細胞間隙可見大量桿狀菌(圖 3F); 除了以上較為嚴重的典型病變,脾臟和心臟也有一定程度的病變: 其中脾臟淋巴細胞壞死崩解可見少量桿狀菌(圖 3G), 心外膜及心內膜大量炎性細胞浸潤(圖 3H), 心臟動脈球外膜外膜空泡樣極度擴張(圖 3I)。

3 討論

在本研究中惡臭假單胞菌感染可引起雜交鲇出現體表皮膚肌肉潰瘍癥, 其潰瘍主要特征為體表出現典型的潰瘍灶, 嚴重者裸露脊柱, 尤以背部肌肉最為明顯。在一定程度上與柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)引起的柱形病、嗜冷黃桿菌(Flavobacterium psychrophilum)引起的冷水病、運動型氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的敗血癥癥狀相似[15]。但柱狀黃桿菌引起的感染主要在鰭條和鰓部, 以爛鰭和爛鰓為主要表現, 皮膚深度潰瘍較少見[22]; 嗜冷黃桿菌引起的冷水病雖然以表皮蒼白褪色、皮膚潰瘍為主要癥狀, 但該病多發生在水溫較低時(發病水溫范圍4—10℃, 水溫15℃時最為嚴重)[23], 而本病發病水溫在20℃左右, 與嗜冷黃桿菌引起的潰瘍病有明顯的流行病學差異; 運動型氣單胞菌感染引起的疾病多以敗血癥為主要表現, 體表潰瘍癥狀較少見[24], 而本病例中除了內臟器官有出血表現外, 還可見體表明顯潰瘍。

表 2 病原菌人工感染健康雜交鲇實驗結果Tab. 2 The mortality of hybrid catfish challenged (intraperitoneal injection) with different doses of the isolate DYJ140914

表 3 菌株DYJ140914的藥敏試驗結果Tab. 3 The sensitivity of isolate bacteria DYJ140914 from a disease outbreak in hybrid catfish to various antimicrobial agents

鲇體表潰瘍癥是危害鲇養殖的主要疾病。從目前研究報道來看, 包括嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[25]、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)[26]、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)[27]、擬態弧菌(Vibrio mimicus)[28]、柱狀黃桿菌(Flavobacterium cloumnare)[29]等多種病原均可引起鲇體表潰瘍癥狀。本研究通過組織病理學技術, 發現皮膚肌肉、肝和腎間組織為本病的主要損傷靶器官, 且在這些組織中明顯可見大量桿狀細菌, 加之腎臟組織觸片中也觀察到相同的桿菌, 故可確定為細菌感染;同時利用生理生化、16S rRNA和gryB基因分析對分離的病原進行進一步鑒定, 最終確定為惡臭假單胞菌感染致病。迄今為止, 惡臭假單胞菌感染引起雜交鲇體表潰瘍的報道, 在國內外尚屬首次。

在假單胞菌屬中, 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)已經被確認為條件致病性病原菌[30—32]。然而,假單胞菌屬的其他菌種也可能是嚴重的條件致病菌, 例如: 分離于日本鰻鱺(Anguilla japonica)的鰻敗血假單胞菌(Pseudonas anguilliseptica)[33], 紅點鮭鱒(Oncorhynchus rhodurus)上分離的綠針假單胞菌(Pseudonas chlororaphis)[34], 香魚(P. altivelis)上分離的變形假單胞菌(Pseudonas plecoglossicida)[35]等, 均可感染水生動物而致病。本研究結果表明,惡臭假單胞菌也可感染雜交鲇, 并且有較強的致病性, 由此表明在目前高密度人工養殖條件下, 惡臭假單胞菌正在逐漸獲得感染水生動物的能力, 可能演變為一種潛在的水產條件致病菌。

此外, 藥敏試驗結果顯示惡臭假單胞菌只對受試的強力霉素、諾氟沙星和左氧氟沙星3種抗生素敏感, 而對β-內酰胺類、氯霉素類、利福霉素類、頭孢菌素類抗生素均具有較強耐藥性。在這3種敏感的抗生素當中, 諾氟沙星已經禁用, 左氧氟沙星未批準使用于水產動物, 僅強力霉素允許用于水產養殖動物, 故強力霉素可作為治療該病的推薦用藥。但相關研究表明, 假單胞菌屬增長速度極快,能快速適應不同的環境條件, 抗生素抗性基因產生迅速。由于在目前中國水產養殖中, 使用抗生素是主要的防病治病策略, 故其不利影響可能持續擴大,使治療更加困難。因此, 構建健康養殖環境, 開發針對性疫苗, 或環境友好的中藥制劑等是防控該病的理想策略。

圖 3 雜交鲇惡臭假單胞菌感染的病理組織學損傷(HE×100, 200, 400, 1000, 標尺=10, 100, 200 μm)Fig. 3 Pathohistological lesions of hybrid catfish infected with Pseudomonas putida (HE×100, 200, 400, 1000)A. 肝臟多灶性壞死; B. 肝細胞間隙內大量桿狀菌; C. 皮膚表皮壞死脫落; D. 肌纖維和肌漿凝固, 間隙內大量短桿菌; E. 腎間質多灶性壞死; F. 間質內大量中性白細胞浸潤, 大量紅細胞積聚, 細胞間隙可見桿狀菌; G. 脾臟淋巴細胞壞死, 少量桿狀菌; H. 心外膜及心內膜炎性細胞浸潤; I. 心臟動脈球外膜空泡樣極度擴張A. Multifocal necrosis in liver; B. Rod-shaped bacteria can observed in the intercellular of liver; C. Epidermis of skin necrosis and shedding; D. Muscle fibers and sarcoplasmic with solidification and honeycomb and many filamentous bacteria exist in muscle fibers; E. Severe focal necrosis in renal interstitium; F. Many erythrocytes, inflammatory cells and rod-shaped bacteria in intercellular of kidney; G. Splenocytes necrosis and with some rod-shaped bacterias; H. Infiltration of inflammatory cells in epicardium and endocardium; I. Adventitia of aortic bulb extreme expansion

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ISOLATION, IDENTIFICATION AND PATHOLOGICAL LESIONS OF PSEUDOMONAS PUTIDA FROM HYBRID CATFISH

DUAN Ya-Jiao1, HUANG Xiao-Li1, ZHAN Gui-Ran2, FAN Wei3, DUAN Jing1, ZHAO Yi-Lin1, DENG Yong-Qiang4, GENG Yi5, CHEN De-Fang1and WANG Kai-Yu5
(1. College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Fisheries Station of Huize County of Yunnan Province, Qujing 654200, China; 3. Neijiang City Academy of Agricultural Sciences, Neijiang 641000, China; 4. Animal Disease Prevention and Control Center of Sichuan, Chengdu 610041, China; 5. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

In order to identify the pathogens of the skin ulcer disease in hybrid catfish, several strains of dominant bacteria (DYJ140914-DYJ140917) were isolated from the diseased fish. They were identified as Pseudomonas putida based on morphology, biochemical, physiology characteristics and sequencing of 16S rRNA and gyrase B subunit (gyrB) gene (GeneBank accession number were KP693689 and KP693690 respectively). They were also proved to be the pathogen of the disease by artificial infection experiment. Histologically, liver, skin, muscle, and renal interstitial were the target organs of the disease, which characterized by multifocal necrotic hepatitis, necrotic myositis, and necrotizing interstitial nephritis. Moreover, it could also lead to mild epicardial and endocardial inflammation, and mild necrotic splenitis. The result of drug sensitivity test showed that the isolates were sensitive to the Doxycycline, Norfloxacin, and Levofloxacin, but were resistant to Ampicillin, Azithromycin, Florfenicol, Sinomin, Mefoxin, Penicillin.

Hybrid catfish; Pseudomonas putida; 16S rRNA; gyrB gene; Pathological lesion

S941.1

A

1000-3207(2017)02-0371-08

10.7541/2017.45

2016-02-24;

2016-06-18

四川省科技支撐項目(2014NZ0027)資助 [Supported by the Science and Technology Support Project of Sichuan Province (No. 2014NZ0027)]

段亞佼(1992—), 女, 甘肅慶陽人; 碩士研究生; 研究方向水生動物疾病學。E-mail: michelle0118@163.com

黃小麗(1979—), 女, 重慶人; 副教授; 主要從事水生動物疾病學的教學與研究工作。E-mail: hxldyq@126.com