光裸方格星蟲野生與養殖群體線粒體控制區序列的遺傳差異分析

周于娜彭銀輝劉旭佳黃國強潘 英蔡小輝,

(1. 廣西大學動物科學技術學院, 南寧 530004; 2. 廣西壯族自治區海洋研究所廣西海洋生物技術重點實驗室, 北海 536000; 3. 廣東海洋大學廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室, 湛江 524088)

光裸方格星蟲野生與養殖群體線粒體控制區序列的遺傳差異分析

周于娜1彭銀輝2劉旭佳2黃國強2潘 英1蔡小輝2,3

(1. 廣西大學動物科學技術學院, 南寧 530004; 2. 廣西壯族自治區海洋研究所廣西海洋生物技術重點實驗室, 北海 536000; 3. 廣東海洋大學廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室, 湛江 524088)

基于線粒體控制區序列對光裸方格星蟲(Sipunculus nudus Linnaeus, 1766)的2個養殖群體(營盤YP、竹林ZL)和4個野生群體(防城港FC、欽州QZ、大冠沙DG和越南海防YN)的91個個體進行遺傳差異分析, 研究光裸方格星蟲養殖和野生群體的遺傳變異情況。結果顯示: 獲得的514 bp DNA序列中, 野生與養殖群體的多態性位點數分別為82和60, 均顯示出對AT的偏倚性。共定義85個單倍型, 共享單倍型4個, 其中共享單倍型Hap5為原始單倍型, 營盤群體均為獨享單倍型。各群體的單倍型多樣性(Hd)相同, 野生群體的平均核苷酸多樣性(Pi)(0.01531)略高于養殖群體(0.01514), 6個群體的遺傳多樣性水平依次為YN＞YP＞QZ＞FC＞ZL＞DG。各群體間的遺傳分化并不顯著(P＞0.05), 光裸方格星蟲的遺傳變異主要來自群體內個體間(99.08%), 同時未發現明顯的地理譜系結構。研究表明, 光裸方格星蟲野生群體的遺傳多樣性水平總體略高于養殖群體; 灘涂底播養殖方式較池塘養殖更利于維持光裸方格星蟲遺傳多樣性; 各群體間不存在顯著的遺傳分化, 養殖群體正逐漸積累遺傳變異, 但尚未足夠以形成其獨立的遺傳結構。

光裸方格星蟲; 線粒體控制區; 野生群體; 養殖群體; 遺傳差異

光裸方格星蟲(Sipunculus nudus Linnaeus)俗稱“沙蟲”, 隸屬方格星蟲目(Sipunculiformes)、方格星蟲科(Sipunculidae)、方格星蟲屬(Sipunculus Linnaeus, 1766), 廣泛分布于除北冰洋外其余三大洋沿岸[1]。光裸方格星蟲的自然資源量在我國沿海自北向南呈遞增的形式分布, 尤其盛產于廣西海區[2]。光裸方格星蟲因其味美、營養豐富且具有較高的藥價性[3]而廣受人們喜愛, 是北部灣重要經濟類海產品之一。

20世紀80年代以來, 隨著人們生活需求快速提高, 對光裸方格星蟲自然資源的“挖掘”日益加重,種質資源逐漸出現衰退現象。為了保護和恢復自然資源, 自2004年起開啟了人工繁育[4], 并在之后親體培育[5]、苗種培育[6]等研究的基礎上, 逐步完善了全人工養殖技術。光裸方格星蟲人工養殖主要集中在廣西沿海, 尤以北海海區為主[7], 其養殖模式主要分為灘涂養殖和池塘養殖兩種[8]。隨著光裸方格星蟲人工養殖的迅速發展, 北海各海區人工養殖光裸方格星蟲平均畝產量和公共灘涂人均采挖量均有顯著增加[4]。

光裸方格星蟲養殖業的快速發展取得了較為可觀的生態和經濟效益。然而, 光裸方格星蟲養殖業快速發展趨生的自發引種、苗種異地交易等現象極易導致光裸方格星蟲種質資源混雜, 遺傳多樣性下降, 嚴重威脅該產業的可持續發展。因此, 亟需開展相應的遺傳多樣性水平檢測和種質資源評估的工作。目前, 已有許多關于光裸方格星蟲的遺傳學研究報道, 主要集中在運用RAPD、微衛星等分子標記對不同地理群體遺傳多樣性的探討[9—13],但至今尚未有基于線粒體DNA控制區序列分析光裸方格星蟲遺傳背景的研究報道。本實驗采用mtDNA控制區序列對光裸方格星蟲不同野生地理群體及不同養殖模式下的養殖群體進行分子遺傳學分析, 旨在揭示兩者的遺傳差異情況, 為評估種質資源和養殖業的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗的4個野生群體分別采自中國防城港(FC)、欽州(QZ)、北海大冠沙(DG)和越南海防(YN), 2個養殖群體分別采自北海營盤(YP)和廣西海洋研究所竹林海水增養殖試驗基地(ZL)。所采集樣本均為光裸方格星蟲成體, 每個地理群體隨機采集20—30尾。樣本活體運回實驗室, 取體壁肌肉于95%酒精中固定, -20℃保存備用, 每個地理群體隨機抽取20個個體用于研究。

切取約30 mg組織, 利用TIANamp Marine A-nimals DNA Kit (北京天根)海洋動物組織基因組DNA試劑盒進行基因組DNA的提取, 經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的完整性后, 4℃保存備用。

根據從GenBank下載光裸方格星蟲線粒體基因組全長序列(Sipunculus nudus Linnaeus, FJ422961.1; KJ754934.1)設計控制區擴增簡并引物: D-Loop 142上: 5′-CACGSCTCCCATTTTCYCTCCGATT-3′; D-Loop1180下: 5′-CCTGYKGTGCGKGTTAT TAARACAAG-3′, 并由南寧市天地楊生物科技有限公司合成。PCR反應體系為25 μL, 包含2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL MgCl2(25 mmol/L)、1 μL dNTPs (10 mmol/L)、0.2 μL Taq聚合酶(2.5 U/μL)、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板1.5 μL,補充無菌水至25 μL。所用試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR反應程序為: 94℃ 預變性5min, 然后94℃變性50s、55℃退火40s、72℃延伸60s, 共運行32個循環, 最后72℃下再延伸10min。所有PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 送至上海立菲生物技術有限公司雙向測序和拼接。

1.3 數據分析

所得拼接序列經MEGA6.0 (Molecular evolutionary genetics analysis)軟件[14]進行比對, 并輔以人工校正, 確定序列比對長度; 再分析序列特征及計算各群體以及群體間的核苷酸組成; 基于Kimura雙參數模型[15]計算遺傳距離, 并構建系統聚類樹; 基于同一模型, 以可口革囊星蟲(Phascolosoma esculenta, GenBank: EF583817.1)為外類群構建單倍型鄰接樹(Neighbor-joining tree, NJ), 系統樹經Bootstrap檢驗。利用DnaSP 5.0[16]確定單倍型和計算各個群體的遺傳多樣性水平。使用Arlequin 3.5[17]軟件進行分子差異分析(AMOVA), 計算遺傳分化系數Fst(F-statistics)并進行顯著性統計。運用Network 4.6[18]軟件構建單倍型的簡約中介(Reduced-Median, MJ)網絡圖。

2 結果

2.1 序列特征

本研究所得光裸方格星蟲線粒體DNA控制區序列共91條, 其中野生群體55條, 養殖群體36條。截取養殖和野生群體序列比對的同源片段, 約514 bp,用于比較分析。養殖群體序列中共檢測出60個多態位點(Polymorphic site), 約占序列堿基總數的11.5%, 其中簡約信息位點(Parsimony informative site) 31個, 單突變位點(Singleton variable site) 29個,平均轉顛換比(Ts/Tv)為24.45。在野生群體中共檢測到82個多態位點, 約占序列堿基總數的15.7%, 其中簡約信息位點和單突變位點各占一半, Ts/Tv為9.30。對控制區序列的堿基組成分析如表 1所示,野生群體(A+T:67.8; G+C:32.2)的值與養殖群體(A+T:67.7; G+C:32.3)基本一致, 且各群體A+T含量均高于G+C。

2.2 群體遺傳多樣性

對不同發育階段與葉功能性狀的相關性分析顯示(表2)，樣地1和樣地2長柄雙花木的發育狀況一致，均與LT、LA呈顯著正相關、與LWC、SLA、LPC呈顯著負相關(P < 0.05)；樣地3和樣地4的長柄雙花木發育狀況一致，均與LT、LA呈顯著正相關、與LWC、SLA、LNC、LPC呈顯著負相關(P < 0.01)。

91條序列共定義了85個單倍型, 其中共享單倍型只有4個(分別為Hap5、Hap32、Hap36、Hap46)。野生與養殖群體分別檢測出了52和36個單倍型(表 2)。Hap5為4個野生群體的共享單倍型; Hap32和Hap36均為防城港與竹林群體的共享單倍型, Hap46為欽州與竹林群體的共享單倍型。營盤群體均為獨享單倍型, 不存在與其他群體共享的單倍型。

統計各群體的遺傳多樣性參數如表 2所示, 各群體的單倍型多樣性(Hd)均為1.000, 野生群體的平均單倍型多樣性(0.996)略低于養殖群體(1.000); 野生群體的平均核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(K)(0.01531、7.77576)均略高于養殖群體(0.01514、7.69048); 綜合核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(K), 各群體的遺傳多樣性大小為YN＞YP＞QZ＞FC＞ZL＞DG。

表 1 光裸方格星蟲控制區序列堿基組成Tab. 1 Nucleotide compositions of control region sequences in S. nudus (%)

表 2 光裸方格星蟲群體的遺傳多樣性參數Tab. 2 Parameters of genetic diversity within S. nudus populations

2.3 遺傳分化和聚類分析

利用MEGA6.0軟件基于Kimura雙參數模型計算群體間的遺傳距離, 由表 3可知, 各群體間的遺傳距離的值差異不大(0.0144—0.0160), 大冠沙(DG)與防城港(FC)群體的遺傳距離最小(0.0144), 而營盤(YP)與防城港(FC)、欽州(QZ)和越南(YN)群體間的遺傳距離最大, 均為0.0160。

兩兩群體間的分化指數Fst顯示(表 3), 各群體間的遺傳分化指數存在一定的差異, 但均未達到顯著水平(P＞0.05)。大冠沙(DG)群體與防城港(FC)群體間的遺傳分化系數最低(-0.01314)而與竹林(ZL)群體的最高(0.03918)。運用Arlequin 3.5軟件計算得出野生群體與養殖群體間的遺傳分化指數為0.00623, 統計檢驗不顯著(P＞0.05)。

由分子差異分析(AMOVA)結果可知(表 4), 光裸方格星蟲群體內個體間的遺傳差異較大(99.08%),而野生和養殖群體間及各群體間的遺傳差異均較小(0.45%; 0.47%)。基于群體間k2-p遺傳距離的聚類分析顯示(圖 1), 6個光裸方格星蟲群體共聚成兩大支, 其中2個養殖群體(YP、ZL)獨立聚成一大支;另一大支則由4個野生群體聚成, 親緣關系較近的DG和FC、YN和QZ先各自聚成一小支, 再匯聚成一大支。

2.4 單倍型分析

光裸方格星蟲群體的單倍型網絡中介圖顯示(圖 2), 各群體單倍型分散分布于各支, 無明顯的與采樣地點相對應的分支, 單倍型連接間的中間節點較多; 略呈星狀分布趨勢, Hap5位于中心位置, 且所占比重最大, 或可推測其為光裸方格星蟲群體的原始單倍型。

基于光裸方格星蟲群體單倍型構建的NJ系統樹(圖 3)表明, 野生和養殖群體的單倍型相互交錯分布于各支, 沒有形成明顯的地理譜系結構。但有些養殖群體的獨享單倍型也逐步形成了小支, 如Hap84和Hap69、Hap63和Hap73等。

表 3 光裸方格星蟲兩兩群體間的分化指數Fst(下三角)和遺傳距離(上三角)Tab. 3 Pairwise Fst(below diagonal) and genetic distance (above diagonal) among S. nudus populations

表 4 光裸方格星蟲群體的分子方差分析Tab. 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the S. nudus populations

3 討論

3.1 光裸方格星蟲野生與養殖群體的遺傳多樣性水平分析

在本研究中, 野生群體和養殖群體堿基組成的A+T含量均高于G+C, 這與許多海洋生物如河鱸(Perca fluviatilis)[19]、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[20]等相似。此外, 光裸方格星蟲如其他環節動物和昆蟲等一樣有著消極的GC偏倚率[21]。

遺傳多樣性水平是評價物種資源的重要指標,水平的高低與物種適應性、生存能力、進化潛能等成正比[22]。在群體遺傳學研究中, 通常以單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)來衡量種群的遺傳多樣性水平的高低[23]。本研究結果顯示, 各群體具有相同的單倍型多樣性(Hd), 而野生群體的平均核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(K)(0.01531; 7.77576)均略高于養殖群體(0.01514; 7.69048), 表明了光裸方格星蟲野生群體的遺傳多樣性水平總體上略高于養殖群體。在水生生物研究中也有類似的報道, 如中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[24]和中國對蝦[20]。養殖群體親本基數足夠大、養殖與野生群體之間存在著基因交流等原因, 而使得養殖群體的遺傳多樣性水平尚未出現顯著降低。

圖 1 基于群體間遺傳距離構建的NJ樹Fig. 1 NJ tree based on genetic distance between populations

光裸方格星蟲群體的遺傳多樣性水平依次為YN＞YP＞QZ＞FC＞ZL＞DG, 其中營盤養殖群體具有較高的遺傳多樣性水平。究其原因, 一是營盤群體放養苗種來源廣, 同時光裸方格星蟲浮游幼體的遷徙特性促進了基因交流, 導致該群體遺傳多樣性較高; 二是其養殖方式的差異影響了遺傳多樣性的水平。營盤群體采自灘涂放養, 而竹林群體則是池塘養殖。前者養殖環境的開放性較強, 開闊的人工灘涂養殖較池塘封閉養殖更有利于資源的恢復。灘涂底播養殖在采挖時, 捕大留小, 即保證了一定數量的親本, 使其可在灘涂上自行繁育, 對資源有保護和恢復作用。國內采用底播增殖模式以恢復或增加生態資源的報道已有不少, 如刺參(Apostichopus japonicas)[25]的底播增殖有助于恢復或增加刺參資源。此外, 皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)[26]、魁蚶(Scapharca broughtonii)[27]、鱗硨磲(Tridacna squamosa)[28]等也有類似的報道。

圖 2 光裸方格星蟲群體控制區序列單倍型中介網絡圖Fig. 2 Median-joining network of S. nudus populations based on control region sequences

竹林養殖群體因累代人工繁育活動且缺乏與外界的基因交流而表現出了較低的遺傳多樣性水平, 但仍略高于大冠沙野生群體, 這是由于竹林群體歷代選擇繁育的親本基數大, 選擇壓力高, 使其人工繁育后代可保持較高的遺傳多樣性水平。但竹林養殖群體的人工后代種質狀況仍有待繼續觀察和研究。

圖 3 基于光裸方格星蟲群體控制區序列構建的NJ系統樹Fig. 3 NJ tree of S. nudus populations based on control region sequences

大冠沙野生群體的遺傳多樣性最低。該海區尚未進行人工放苗養殖活動, 且長期過度采挖、非法高壓水槍的使用等可能使該區域的方格星蟲種質資源出現一定程度上的衰退。

3.2 光裸方格星蟲野生群體與養殖群體的遺傳結構分析

NJ樹顯示, 光裸方格星蟲的養殖和野生群體分別聚類為兩大支。郭昱嵩等[10]在對北部灣光裸方格星蟲地理群體研究中發現聚在一起的群體其地理位置相鄰, 而本研究中并無明顯類似現象。欽州與越南群體聚類為一支, 這極大可能是由于欽州曾從越南引種而引起[12]。

遺傳距離研究結果顯示, 大冠沙與防城港群體親緣關系最近, 而營盤養殖群體與防城港、越南、欽州野生群體的同源性最低。遺傳分化指數結果顯示, 各群體間存在著一定的分化, 但均不顯著(P＞0.05), 且養殖群體與野生群體間尚未存在顯著分化(0.00623; P＞0.05); 其中大冠沙群體與防城港群體遺傳分化最低, 與竹林養殖群體的遺傳分化較高。肖明松等[29]發現長吻(Leiocassis longirostris)野生群體與養殖群體間有著較小遺傳變異, 這與本研究結果相似。光裸方格星蟲的遺傳變異主要來自群體內個體間(99.08%), 群體間的遺傳差異較低。由上述可知, 光裸方格星蟲各群體間已經存在著不顯著的分化, 主要是養殖群體與野生群體間的遺傳分化, 但分化的強度不大。

光裸方格星蟲的單倍型中介網絡圖和系統樹均未檢測到明顯的地理譜系結構。類似的結果在條石鯛(Oplegnathus fasciatus)[23]和中國近海褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[30]中也有報道。在本研究中, 網絡圖的單倍型連接間的中間節點較多, 暗示尚有許多隱藏單倍型未被檢測出來; 單倍型略呈星狀分布趨勢, 表明光裸方格星蟲歷史上出現過種群擴張事件[18]。Hap5為4個野生群體的共享單倍型,中介網絡圖也顯示其位于中心位置, 頻率高, 并且與其連接突變的單倍型最多, 據此可推測其為光裸方格星蟲的原始單倍型。值得注意的是, 營盤群體的單倍型均為獨享單倍型, 且Hap84、Hap69等養殖群體的獨享單倍型也逐步形成了獨立小支, 這些現象提示了養殖群體正在積累遺傳變異, 但尚未足夠以形成其獨立的遺傳結構。

基于本研究結果, 我們認為今后應繼續堅持較高選擇強度的人工選繁親本策略, 盡可能保證一定的親本數量和質量, 并開展人工良種選育工作。對于公共海區的自然群體資源, 采取更為明確、科學、合理的資源保護及恢復措施, 從而保證光裸方格星蟲的野生資源遺傳多樣性處于一個良好的水平。

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GENETIC VARIATION ANALYSIS ON WILD AND CULTURED POPULATIONS OF SIPUNCULUS NUDUS INFERRED FROM MTDNA CONTROL REGION SEQUENCES

ZHOU Yu-Na1, PENG Yin-Hui2, LIU Xu-Jia2, HUANG Guo-Qiang2, PAN Ying1and CAI Xiao-Hui2,3
(1. College of Animal Science and Technology of Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology, Guangxi Institute of Oceanology, Beihai 536000, China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, Zhanjiang 524088, China)

Sipunculus nudus is one of the commercially important inshore demersal species. Understanding the population genetic of this species is a critical component of conservation management and artificial reproduction. However, few studies were reported about the genetic variation between wild and cultured population. The current study employed ninety-one mitochondrial DNA control region sequences to analyze the genetic variation of two cultured (Yingpan and Zhulin in Beihai) and four wild (Daguansha, Qinzhou, Fangchenggang in China and Haiphong in Vietnam) populations of S. nudus. Results showed that sixty and eighty-two polymorphic sites were detected in cultured and wild populations based on the 514 bp sequence, respectively. A negative GC-skew was found in mtDNA control region sequences of S. nudus. Eighty-five haplotypes were identified from control region sequences, among which 4 haplotypes were shared by all populations except Yingpan. According to the Median-joining network, the Hap5 was the chief ancestral haplotype of S. nudus. The average nucleotide diversity (Pi) (0.01514) of cultured populations was slightly lower than the wild populations (0.01531), and all populations had the same haplotype diversity (Hd). The order of genetic diversity for six populations was: YN＞YP＞QZ＞FC＞ZL＞DG. No significant (P＞0.05) genetic differentiations were detected among populations in terms of the genetic distance and fixation index (Fst). The AMOVA analysis indicated that the genetic variance mainly appeared within populations (99.08%). Non-significant genealogical structures were found from NJ and Median-joining network analyses among populations. The genetic diversity of wild population was slightly higher than the cultured populations. The bottom sowing culture was more beneficial to maintain high level genetic diversity of S. nudus. Meanwhile, the genetic differentiations existed among populations were not significant, and the cultured population accumulated genetic variations try to form its own genetic structure.

Sipunculus nudus; mtDNA control region; Wild population; Cultured population; Genetic variation

Q75; S917.4

A

1000-3207(2017)02-0384-07

10.7541/2017.47

2016-05-14;

2016-07-11

國家自然科學基金(31160532); 廣西科學研究與技術開發計劃項目(桂科攻14121006-2-1); 廣西自然科學基金(2015GXNSFBA 139081); 廣西科學院基本科研業務費(15YJ22HYS13)資助 [Supported by the National Natural Science of China Foundation (31160532); Research Program of Science Technology Department of Guangxi Province (Gui S&T Tackle 14121006-2-1); Natural Science Foundation of Guangxi Province of China (2015GXNSFBA139081); Basic Scientific Research Service Fee of Guangxi Academy of Sciences (15YJ22HYS13)]

周于娜(1992—), 女, 廣西南寧人; 在讀碩士研究生; 主要從事海洋經濟動物遺傳與育種研究。E-mail: nnzhouyuna@163.com

彭銀輝(1981—), E-mail: pyinhui@163.com; 潘英(1968—), E-mail: yingpan@gxu.edu.cn