QuEChERS—液相色譜法分析測定葡萄中噻菌靈及其不確定度評估

摘 要 建立液相色譜法（HPLC）快速分析測定葡萄中噻菌靈的方法，樣品用乙腈提取，QuEChERS凈化，紫外檢測器檢測，并用外標法計算含量。結果表明：用QuEChERS前處理方法，噻菌靈在0.05～1.00 mg·kg-1具有良好線性關系（r=0.999 2），檢出限為0.03 mg·kg-1，平均加標回收率為75%～95%，相對標準偏差2.3%，樣品中噻菌靈測定值 .240.015 6 mg·kg-1，取包含因子k=2，對應置信水平95%，其合成不確定度為0.007 8 mg·kg-1，其擴展不確定度為0.015 6 mg·kg-1。采用該方法測定葡萄中噻菌靈殘留量，簡便、快速、準確。

關鍵詞 葡萄；噻菌靈；殘留量；測定；不確定度評估；液相色譜法

中圖分類號：TS201.6；O657.7+2；S663.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.25.007

知網出版網址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20170908.1515.029.html 網絡出版時間：2017/9/8 15：15：42

我國是一個農業大國，在農業生產中，農藥發揮了不可忽視的作用，但是農藥殘留成為伴隨而來的突出問題。苯并咪唑類藥物作為光譜性內吸殺菌劑，被廣泛應用于水果生產，而噻菌靈是苯并咪唑類農藥的主要種類。這類物質對熱、酸、堿和光都很穩定，在自然環境中降解較慢，對人、畜有一定的毒副作用[1-3]。目前應用于噻菌靈檢測的前處理方法很多，其中常用的有液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取法和分散液相萃取法[3]。應用于農藥檢測的方法有很多種，苯并咪唑類農藥儀器分析應用較多，而廣大縣鄉（鎮）級基層農產品檢測中心儀器條件有限，少有液質質或氣質質等大型檢測儀器，大多配備有氣相和液相分析儀器。

噻菌靈的檢測方法常采用高效液相色譜法[4-5]。但關于葡萄基質中噻菌靈的QuEChERS-液相色譜法檢測分析文獻報道比較少，其測量不確定度評定研究更是缺乏。本實驗采用QuEChERS前處理-高效液相色譜法分析測定葡萄中的噻菌靈，并對其進行不確定度評定，為今后該方面研究和縣鄉（鎮）級實驗室提供參考。

1材料與方法

1.1原料

無核白葡萄、赤霞珠等，采自新疆吐魯番、昌吉、鄯善等地區。

1.2試劑

乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司。

甲醇：色譜純，美國Fisher Scientific公司。

磷酸：分析純，西安化學試劑廠。

氯化鈉：分析純，天津盛奧化學試劑廠，140℃烘4 h。

無水硫酸鎂：分析純，天津盛奧化學試劑廠，650℃烘4 h。

乙酸銨：分析純，天津盛奧化學試劑廠。

QuECHERS萃取試劑盒：MgSO4，1 200 mg；PSA，400 mg，15 mL，安捷倫科技（中國）有限公司。

微孔濾膜：0.20 μm，北京振翔工貿有限公司。

葵烷磺酸鈉：純度≥98%，天津光復精細化工研究所。

三乙胺：天津富宇精細化工有限公司。

離子對試劑：吸取7.0 mL磷酸于200 mL水中，加入1.0 g癸烷磺酸鈉，溶解，再加入10.0 mL三乙胺，稀釋至1 000 mL，調節pH值為2.4。

1.3儀器

高效液相色譜儀：Waters e2695 Alliance型，配可調波長紫外檢測器（2489UV/VIS），美國Waters公司。

高速冷凍離心機：TECHCOMP CT15RT型離心機，上海天美科學儀器有限公司。

旋轉蒸發器：N-1100型，上海EYELA公司。

漩渦混合器：MS3 digiyal型，IKA公司。

分析天平：PB303-E型，感量0.01 g，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：C18柱 100A（250 mm×4.60 mm，5μm），美國Phenomenex公司。

流動相：甲醇+離子對試劑（60+40），流速0.80 mL/min。

檢測器：配可調波長紫外檢測器（2489UV/VIS），美國Waters公司。

檢測波長：300 nm。

色譜柱溫度：30℃。

進樣：10.00 μL。

1.4.2 溶液配制

1.4.2.1標準溶液制備

噻菌靈標準儲備溶液：1 000 μg·mL-1，甲醇溶解。低溫避光保存，根據需要用流動相配制成適當濃度的標準系列工作溶液，需現用現配。

標準工作液：分別準確吸取1 mL的噻菌靈標準儲備溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得20 μg·mL-1的標準溶液；再從20 μg·mL-1的標準溶液中分別吸取2.5 mL加入到50 mL容量瓶中，加流動相（1.2）定容，得1 μg·mL-1的標準溶液；從1 μg·mL-1的標準溶液中分別吸取1.0， 2.0， 5.0， 8.0 mL加入到10 mL容量瓶中，加流動相（1.2）定容，得標準曲線溶液；每個質量濃度取10 μL，進高效液相色譜儀進行分析。

1.4.2.2樣品前處理

稱取供試試料（10±0.05） mL于50 mL具塞離心管中，先加入10.0 mL乙腈，再加入1.0 g 氯化鈉、4.0 g 無水硫酸鎂，劇烈振蕩，用離心機 10 000 r·min-1離心1 min。準確吸取6.00 mL上層乙腈相溶液于15 mL QuECHERS萃取試劑盒中，劇烈振蕩，用離心機

10 000 r·min-1離心1 min。吸取上層乙腈相溶液1 mL，再加入1.0 mL甲醇水（1+1）定容，過0.20 μm濾膜，待進行液相色譜分析。

2結果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的優化

甲醇和離子對試劑在流動相中的比例，對出峰效果影響較大，本實驗先后采用甲醇+離子對試劑比例為（80+20）、（60+40）、（40+60）的流動相，對比噻菌靈標準的出峰效果。 確定在甲醇+離子對試劑（60+40）的流動相條件下，溶劑峰與標準峰能夠實現完全分離，峰型尖銳，實驗結果良好?？瞻准訕藰悠返纳V圖，如圖1。

2.1.2 前處理條件的選擇

對葡萄樣品進行乙腈提取，QuECHERS試劑盒凈化，選擇不濃縮和濃縮2種處理方式，發現濃縮上樣的方法雖然處理時間增加，但檢出限明顯好于不濃縮處理。

2.2標準曲線和最低檢出限

在實驗條件下，以峰面積y為縱坐標，質量濃度x（mg·kg-1）為橫坐標繪制標準曲線，得線性方程，以基線噪聲3倍的峰面積對應的質量濃度為檢出限

（S/N=3），回歸方程、相關系數及檢出限見表1。

2.3精密度和加標回收實驗

樣品處理方法進行樣品處理，重復3次。按“2.1”節色譜條件進行測定，精密度和回收率計算結果見表2。采用本方法所得數據滿足檢測要求。

2.4葡萄樣品監測結果

對烏魯木齊市市售葡萄樣品30份進行了測定，其中1份樣品檢出了噻菌靈0.12 mg·kg-1，檢出率為3.33%。

2.5測定方法的不確定度計算

2.5.1 不確定度的數學模型

根據液相色譜儀的測定原理，農藥殘留含量計算公式如下：

X= （1）

（1）式中：X為待測樣品中農藥殘留含量，mg·kg-1；c0為待測樣品中農藥殘留濃度，mg·L-1；v0為樣品定容體積，mL；m為待測樣品質量，g；f為濃縮倍數，本方法下取值0.5。

2.5.2 試樣中農藥殘留的不確定度合成式

根據不確定度的傳播規律，由公式（1）可得到樣品中農藥含量的相對合成不確定度Ur（X）為：

（2）

2.5.3 不確定度各分量值的計算

2.5.3.1試樣噻菌靈濃度的不確定度U（c0）

試樣中噻菌靈濃度c0的不確定度由以下三部分合成：1）標準儲備液自身的不確定度；2）由標準溶液濃度-峰面積響應曲線求得c0產生的不確定度；3）由標準儲備液配制標準曲線系列稀釋所產生的不確定度。

2.5.3.1.1標準儲備液產生的不確定度U（ρ）

購買標準品的證書標注純度為99%，則其標準不確定度為1/ （按照矩形分布考慮，取k= ），所以U（ρ）=0.58 mg·L-1，其相對標準不確定度為Ur（ρ）=U（ρ）/ρ=0.58/1 000=0.000 58。

2.5.3.1.2五種濃度標準曲線求得c0產生的標準不確定度U（c0）

根據上述實驗條件對標準系列分別進行3次測定，其峰面積結果見表3。

將表3所測數據建立回歸校正曲線，其擬合所得曲線方程為：A=2 983C+126。同時按照測定方法將葡萄試樣測定2次，根據校準曲線方程求得試樣濃度c0=0.12 mg·L-1，則U（c0）由下式計算：

U（c0）= （3）

（4）

式中：B1為校準曲線的斜率，其值為2 983；p為試樣溶液測定的次數，p=2；n為標準溶液測定的次數，n=15；c0為試樣溶液中農藥的濃度，mg·L-1； 為校準曲線中農藥的平均濃度，mg·L-1；Cj為校準曲線中農藥的標準濃度，mg·L-1；Aj為校準曲線溶液中待測農藥峰面積的測定值。

將表3的數據代入公式（3）和（4）進行計算，其中：

= =10.431 4

= =0.52

則U（c0）= =

=0.002 835

所以 =0.023 6

2.5.3.1.3標準儲備液配制成5種標準溶液時產生對c0的測量帶來的不確定度

c1=0.1 mg·L-1標準溶液，是將儲備液（1 000 mg/L）按1∶50，1∶20，1∶10分3次稀釋到0.1 mg·L-1。1∶50稀釋標準溶液時，使用1.00 mL移液管吸取1 mL標準儲備液（1 000 mg·L-1）定容到50 mL容量瓶，得20 mg·L-1標準溶液；1∶20稀釋標準溶液時，使用5.00 mL移液管吸取2.5 mL標準溶液（20 mg·L-1）定容到50 mL容量瓶，得1.0 mg·L-1L標準工作溶液；1∶10稀釋標準溶液時，使用100 mL移液管吸取1 mL標準溶液（1.0 mg·L-1）定容到10 mL容量瓶，得0.1 mg·L-1標準工作溶液。

這里不確定度主要分為校準、重復性和溫度影響。

1）校準：

1.00 mL移液管（A級）在20℃，允許誤差為0.007 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.007/ =0.004 04 mL；5.00 mL移液管（A級）在20℃，允許誤差為0.025 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.025/ =0.014 mL；50 mL容量瓶（A級）在20℃，允許誤差為0.05 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.05/ =0.029 mL；10 mL容量瓶（A級）在20℃，允許誤差為0.02 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.02/ =0.012 mL。

2）重復性：

對1.00 mL移液管（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.002 2 mL；對5.00 mL移液管（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.011 mL；對50 mL容量瓶（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.015 mL；對10 mL容量瓶（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.008 mL。

3）溫度：

在20℃為校正溫度，假設實驗室溫度與校正溫度相差3℃，產生的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數來計算，甲醇的體積膨脹系數為1.24×10-3 mL·℃-1，則95%置信概率時體積變化的區間轉換成標準偏差。

1.00 mL移液管（A級）移取1.00 mL甲醇，得出其體積的標準偏差為3×1×1.24×10-3/ =0.002 15 mL；5.00 mL移液管（A級）移取5.00 mL甲醇，得出其體積的標準偏差為3×5×1.24×10-3/ =0.010 7 mL；50 mL容量瓶（A級）進行移取1.00 mL甲醇，得出其體積的標準偏差為3×50×1.24×10-3/ =0.107 mL；10 mL容量瓶（A級）進行移取1.00 mL甲醇，得出其體積的標準偏差為3×10×1.24×10-3/ =0.021 5 mL。

合成以上三項，稀釋成C1濃度時產生的相對標準不確定度：

按上述步驟計算C2、C3、C4、C5，其中參考值增加10 mL移液管（A級）校準、重復性、溫度數據如下。

1）校準：

10.00 mL移液管（A級）在20℃，允許誤差為0.05 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.05/ =0.028 9 mL。

2）重復性：

對10.00 mL移液管（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.013 mL。

3）溫度：

10.00 mL移液管（A級）移取8 mL、10 mL甲醇，得出其體積的標準偏差分別為3×8×1.24×10-3/ =0.017 2 mL和3×10×1.24×10-3/ =0.021 5 mL。

得：

合成以上5個分量，標準儲備液配制成5種標準溶液時產生對c0的測量帶來的不確定度：

合成2.5.3.1.1、2.5.3.1.2和2.5.3.1.3步驟，得到c0的相對標準不確定度：

=0.030 7

2.5.3.2試樣提取定容體積v0的不確定度

樣品提取處理時經過如下步驟：用10.00 mL移液管加入10.00 mL乙腈，再吸取6 mL凈化，然后用5.00 mL移液管吸取5.00 mL乙腈樣品提取液濃縮，用1.00 mL移液管加入1.00 mL甲醇水（1+1）的溶液定容。

參考“2.5.3.1.3”的步驟，計算v0的不確定度。

1）校準

1.00 mL移液管（A級）在20℃，允許誤差為0.007 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.007/ =0.004 04 mL；10.00 mL移液管（A級）在20℃，允許誤差為0.05 mL，按均勻分布轉換成標準偏差為0.05/ =0.028 9 mL。

2）重復性

對1.00 mL移液管（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.002 2 mL；對10.00 mL移液管（A級）進行重復11次測定，得出其體積的標準偏差為0.013 mL。

3）溫度

在20℃為校正溫度，假設實驗室溫度與校正溫度相差3℃，乙腈的體積膨脹系數1.37×10-3 mL/℃，水的體積膨脹系數2.1×10-4 mL/℃；10.00 mL移液管（A級）移取10 mL、6 mL乙腈，得出其體積的標準偏差分別為3×10×1.37×10-3/ =0.023 7 mL和3×5×1.37×10-3/ =0.014 2 mL；1.00 mL移液管（A級）移取1.00 mL乙腈提取液，得出其體積的標準偏差為3×1×1.37×10-3/ =0.002 37 mL；1.00 mL移液管（A級）移取1.00 mL甲醇，得出其體積的標準偏差為3×0.5×1.24×10-3/ =0.001 07 mL；1.00 mL移液管（A級）移取1.00 mL水，得出其體積的標準偏差為3×0.5×2.1×10-4/ =0.000 182 mL。

合成以上三項，提取定容體積產生的相對標準不確定度：

2.5.3.3樣品稱樣量m的不確定度

使用天平的線性分量為0.01 g，按照均勻分布轉化為標準偏差為0.01/ =0.005 8 g，所以稱量產生的相對標準不確定度為Ur（m）= /2.000=0.004 1（因為要扣零，應重復計算2次）。

2.5.4 合成不確定度的計算

合成標準不確定度的計算由公式（2）得到：

；

由公式（1）得到：X= = =0. 24

所以U（X）=Ur（X）·X=0.032 5×0. 24 mg·kg-1 =0.007 8

2.5.5 擴展不確定度的計算

本次試驗結果的擴展不確定度取包含因子k=2，對應置信水平95%，其擴展不確定度U=k×U（X）=0.015 6 mg·kg-1。所以葡萄中噻菌靈的含量結果報告表述為：X=0.240.015 6 mg·kg-1，k=2，對應置信水平95%。

從表4可以看出，用液相色譜法測定葡萄中噻菌靈含量時，影響噻菌靈含量測定不確定度的最主要因素是由標準曲線校準所得濃度產生的不確定度，因此在進行曲線校準及樣品的測定時，應將儀器設備各項測定條件的參數優化組合，根據實驗經驗適當調整儀器參數及選擇合適紫外波長，使其處于最佳測定狀態。同時應使待測液濃度在曲線中間部位，減少偏差。由標準儲備液配制標準曲線系列稀釋所產生的不確定度也是主要因素，因此在曲線配制的過程中，要使用濃度準確的標準儲備液，并且使用計量檢定合格的移液管及容量瓶配置標準曲線；在校準曲線的配制過程中，熟練掌握移取的操作和讀數技能；同時保證移液管清潔，防止因玷污溶液掛壁而引起溶液移取體積有誤差。

總之，實驗各個操作過程和環節都會產生一定的不確定度，因此必須認真對待實驗的每一個過程，加強質量控制，減少誤差，以提高測定結果的準確度。

3結論

本實驗建立液相色譜快速分析測定葡萄中噻菌靈的方法，樣品用QuEChERS方法提取凈化，結果表明：用QuEChERS前處理方法，噻菌靈在0.05～1.00 mg·kg-1具有良好線性關系（r=0.999 2），檢出限為0.030 2 mg·kg-1，加標回收率在77%～89.1%；采用該方法測定葡萄中噻菌靈殘留量，簡便、快速、準確。QuEChERS-液相色譜法分析測定葡萄中噻菌靈含量測量不確定度結果為X=0.240.015 6 mg·kg-1，取95%的置信概率，k=2。

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（責任編輯：丁志祥）