離子色譜法測定發芽大豆中的γ—氨基丁酸的方法研究

摘 要 建立離子色譜法測定發芽大豆中γ-氨基丁酸（GABA）含量的快速、簡便分析方法。樣品用碳酸鈉-碳酸氫鈉2.4 mmol/L溶液提取后，過0.22 μm濾膜后進行色譜分析。選用IonPac AS 18陰離子交換分析柱，IonPac AG 18陰離子保護柱，梯度洗脫的方式分離，過電導檢測器測定含量。該方法簡單、快速、靈敏度高且結果可靠，獲得良好的加標回收率，可用于快速測定發芽大豆中γ-氨基丁酸含量。

關鍵詞 離子色譜；發芽大豆；γ-氨基丁酸；GABA

中圖分類號：S565.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.28.031

知網出版網址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.S.20171011.1400.019.html 網絡出版時間：2017/10/11 14：00：19

γ-氨基丁酸（GABA）廣泛分布在動物和植物中，其具有很強的生物活性，是哺乳動物的一種重要神經遞質[1]。有研究表明，GABA具有激活腦內葡萄糖代謝、促進乙酰膽堿合成、抗驚厥、降血壓、改善腦機能、神經安定、促進生長激素分泌等多種生理功能[2]。富集GABA的方法研究較多，其中采用植物富集方法是普遍認為最安全的方法，即控制植物的生長環境，使之能夠最大限度地積累GABA。由于豆類中富含谷氨酸，在發芽過程中經谷氨酸脫羧酶催化將轉化成GABA，使用發芽豆類富集GABA是研究的熱點[3]。

檢測GABA的方法有很多種，其中最常用的有比色法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀法等。比色法具有一定局限性，容易受到樣品本身顏色的干擾；高效液相色譜法需要將樣品進行衍生化處理，實驗步驟繁瑣且成本較高；氨基酸分析儀法對測定條件及樣品均有很高要求[4]。為此，以發芽大豆作為研究對象，采用離子色譜法，探討優化樣品前處理方法以及色譜條件，旨在開發一種簡單、快速、靈敏度高且結果可靠的GABA檢測方法，為研究GABA在發芽大豆中的富集提供幫助。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1）發芽大豆。選取3種不同生長時期的發芽大豆作為研究對象，芽長分別為1～3 cm，3～6 cm，6～10 cm。

2）γ-氨基丁酸。純度99.2 %，SIGMA-ALORICH，Lot：BCBT6565。

3）無水碳酸鈉。分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。

4）碳酸氫。分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。

5）超純水。電阻率為18.2 MΩ/cm，美國Millipore純水儀。

6）0.22 μm尼龍濾膜。購于天津津騰公司。

7）ICS 5000離子色譜儀。購于美國戴安公司。

8）EGC 500 OH-離子發生器。購于美國戴安公司。

9）電導檢測器。購于美國戴安公司。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：IonPac AS 18陰離子交換分析柱（250 mm×4 mm）；IonPac AG 18陰離子保護柱（50 mm×4 mm）；ASRS 400 型抑制器，自循環模式，抑制電流：100 mA；KOH濃度梯度：0～13 min，4 mmol·L-1；13.1～18 min，40 mmol·L-1；18 .1～23 min，4 mmol·L-1；流速1.0 mL·min-1；進樣量50 μL。

1.2.2 標準溶液配制及曲線繪制

稱取1.0056 g GABA標準品，定容至100 mL容量瓶，即濃度為10 g·L-1的標準儲備液，稀釋配制標準成1000 μg·mL-1標準使用液。配制標準曲線：取GABA標準液稀釋配制濃度分別是100 μg·mL-1、80 μg·mL-1、50 μg·mL-1、40 μg·mL-1、25 μg·mL-1、20 μg·mL-1。

1.2.3 樣品預處理

準確稱取粉碎后樣品約0.5 g于50 mL比色管中，用碳酸鈉-碳酸氫鈉2.4 mmol·L-1溶液定容至刻度，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min，溫度50℃，靜置30 min，在4℃條件下離心8000 r·min-1，20 min。取上清液，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.2.4 樣品凈化及分析測定

吸取樣品管中層液體，過0.22 μm水性樣品濾膜，棄去前3滴試液，以同樣方法上機測定樣品液，由標準曲線計算含量。含量計算公式如下：

式中：X 為樣品中目標物的含量（mg·kg-1）；Y為由標準曲線得到樣品溶液中目標物的濃度（μg·mL-1）；V為樣品溶液定容體積（mL）；m為樣品質量（g）。

2結果與分析

2.1樣品前處理條件的選擇

樣品提取液的選擇，GABA其不溶于有機溶劑，易溶于水[5]，因此考慮采用水相試劑提取。且在加熱條件下GABA極易分解形成吡咯烷酮和水[3]，提取時不宜選擇過高的溫度。嚴聃[6]使用檸檬酸溶液在pH6.0時，50℃水浴提取4 h，提取米糠中的GABA得到較好提取效果；廖周華等[7]以水為提取介質（pH7.0），溫度37℃、抽提6 h，提取麥麩中的GABA有較好效果；李炳坤等[8]采用碳酸鈉-碳酸氫鈉2.4 mmol/L溶液為介質提取桑葉中的GABA取得較好結果。綜上，本文研究了不同提取介質對于GABA的提取效果的影響。發現檸檬酸對于離子色譜基線有較大干擾，不適合于離子色譜法提取，碳酸鈉-碳酸氫鈉提取效果較好，詳見表1。

靜置時間的選擇，多數研究認為[7-8]，在50℃時，為提取樣品中GABA的適宜溫度。對于提取時間則有較大分歧，因此本文參考50℃為提取溫度，研究了不同提取時間對于GABA提取效果的影響，結果見表2。

由結果分析可知，不同提取介質對于提取發芽大豆中GABA的效率有較大影響，采用碳酸鈉-碳酸氫鈉為介質提取GABA有較好效果。在相同溫度條件下，延長靜置時間對于提取效率未見明顯改善。本研究增加了30 min超聲波提取，提取效率有明顯提高。

2.2色譜條件的選擇

比較了3種陰離子分析柱的分離效果。IonPac AS 16陰離子交換分析柱，是親水性較強的高容量柱，GABA在柱中的保留時間較短，低濃度洗脫時約6.00 min出峰，不能保證GABA能完全分離。IonPac AS 19陰離子交換分析柱，是高通量柱，GABA在其中有較長的保留時間，但在GABA出峰前0.2 min處存在雜峰干擾，使之無法完全分離。因此，本研究最終選用IonPac AS 18陰離子交換分析柱，在4 mmol·L-1濃度OH-離子洗脫將目標物分離，使用50 mmol·L-1的高濃度洗脫液沖洗色譜柱，可獲得平穩基線和良好的峰形，如圖1所示。

2.3線性范圍

配制多個濃度梯度的標準品進行線性范圍分析，結果表明，在20～100 μg·mL-1時，各組分的濃度與峰面積有良好的線性關系，以組分的質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（μS×min）為縱坐標，回歸方程為：y=0.006x+0.021，R2 = 0.998 6。

選擇濃度20 μg·mL-1準品溶液，按“1.2.1”的色譜條件進行測定，GABA的儀器檢出限為0.07 μg·mL-1 （信噪比RSN=3），以0.5 g稱樣量計算方法檢出限為7 mg·kg-1。

2.4樣品分析及加標回收率

選取具有代表性的3種不同芽長的發芽大豆作為研究對象，芽長分別為1～3 cm，3～6 cm，6～10 cm。在樣品中添加已知濃度的GABA標準品進行樣品分析及加標回收試驗（n=6）。

如表3所示，樣品中的GABA，樣品加標后回收率在89.46%～104.00%，相對標準偏差（RSD）在3.16%～8.11%。

由圖2可以看出，樣品的特征峰與標準品（圖1）出峰時間重合，分離度較好。由此可見，本方法穩定可靠，準確性高。

3結論

本實驗建立了能夠快速測定發芽大豆中GABA的離子色譜方法。該法與其他方法相比，能夠有效節約檢測時間及檢測成本，分析速度快，結果穩定可靠。

參考文獻：

[1]郭曉娜，朱永義，朱科學.生物體內γ-氨基丁酸的研究[J].氨基酸和生物資源，2003，25（2）：70-72.

[2]蔣振暉，顧振新.高等植物體內γ-氨基丁酸合成、代謝及其生理作用[J].植物生理學通訊， 2003，39（3）：249-254.

[3]渠巖，王夫杰，李平蘭，等.γ-氨基丁酸及其在大豆發酵食品中的研究進展[J].中國釀造，2010，（3）：1-4.

[4]劉紅梅，魏淘濤，劉行丹，等.發芽糙米γ-氨基丁酸的檢測及研究進展[J].作物研究，2012，26（1）：88-92.

[5]陳恒文，林碧敏，鐘楊生，等.γ-氨基丁酸活性功能研究綜述[J].廣東蠶業，2011，45（4）：27-32.

[6]嚴聃.從米糠中提取高濃度γ-氨基丁酸粉末的工藝條件研究[J].食品與機械，2009，25（4）：80-82，162.

[7]廖周華，陳銘志，李彩娟.麥麩提取γ-氨基丁酸工藝的優選[J].亞熱帶農業研究，2010，6（4）：267-270.

[8]李炳坤，衷明華.離子色譜法測定桑葉中的γ-氨基丁酸[J].韓山師范學院學報，2009，30（6）：62-65.

（責任編輯：敬廷桃）