微生物溶解內(nèi)蒙古褐煤影響因素及產(chǎn)物分析

摘要：利用產(chǎn)堿假單胞菌、施氏假單胞菌、銅綠假單胞菌和粗毛栓菌4種微生物對內(nèi)蒙古褐煤進(jìn)行溶煤實驗，探索了煤樣粒度、氧化程度、溶煤時間和溶煤方式等因素對溶煤率的影響，并對溶煤產(chǎn)物進(jìn)行了紅外光譜（IR）、紫外光譜（UVVIS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煤樣粒度為0074～0125 mm，氧化程度為10 mol/L硝酸浸泡處理48 h，溶煤時間為14 d和以搖瓶培養(yǎng)的方式進(jìn)行溶煤時效果最好，此條件下銅綠假單胞菌的溶煤率最高，達(dá)6261%.IR分析結(jié)果顯示，殘煤紅外光譜圖與氧化煤紅外光譜圖相比，羥基振動峰增強(qiáng)，芳烴結(jié)構(gòu)振動峰減弱；UVVIS分析結(jié)果顯示，溶煤產(chǎn)物的主要成分為苯酚衍生物、醛類和醚類化合物；GCMS分析結(jié)果顯示，氧化煤經(jīng)過微生物溶解以后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，部分溶解為低分子量化合物。關(guān)鍵詞：微生物；溶煤產(chǎn)物；紅外光譜；紫外光譜；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中圖分類號：TQ 5361

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Abstract：Biosolubilization of Inner Mongolia lignite by Pseudomonas alcaligenes，Pseudomonas stuzeri，Pseudomonas aeruginosa and Trametes hirsute were studied.The grain size of coal sample，degree of oxidation，time of biosolubilising coal and the mode of biosolubilising coal were investigated，which influenced the percentage of biosolubilization.The coal biosolubilization products were characterized by UVVIS，IR spectrum and GCMS.The results showed that the percentage of biosolubilization was better when the coal sample size was 0074～0125 mm，oxidized by 10 mol/L nitric acid for 48 hours，biosolubilising time was 14 days and shaking culture was chosen，Pseudomonas aeruginosa was the highest，which was 6261%.IR analysis showed the residual coals comparing with oxidized coal had stronger hydroxyl vibration peak and weaker aromatic vibration peak.UVVIS analysis showed the main components of products are phenol derivatives，aldehydes and ethers.According to GCMS analysis，the structure of oxidized coal was partly changed into low molecular weight compounds after the process of biosolubilization.Key words：microorganism；biosolubilization product；IR；UVVIS；GCMS

0引言中國褐煤資源十分豐富，儲量達(dá)1 300億t，占中國煤儲量的13%，其中內(nèi)蒙古褐煤儲量占中國褐煤總儲量的3/4以上[1-2]。煤的直接燃燒會釋放大量的氮化物和硫化物等有毒氣體，引起一系列的環(huán)境問題[3]。煤的潔凈處理和利用成為煤“綠色”利用的途徑，煤的微生物溶解就是其中的一種方法，這是由于煤是植物遺體在地層下經(jīng)過長期的作用形成的[4-7]，煤中還保留有大量的木質(zhì)素與多環(huán)芳烴等物質(zhì)結(jié)構(gòu)[8-10]，因此，利用微生物來實現(xiàn)煤中木質(zhì)素和多環(huán)芳烴等結(jié)構(gòu)的溶解與液化是行之有效的途徑之一。自上世紀(jì)80年代德國Fakoussa博士[11]和美國Cohen教授[12]分別報道了某些真菌能在煤塊上生長，并將煤轉(zhuǎn)化成黑色水溶液以來，煤的微生物轉(zhuǎn)化在世界上已引起了許多研究者的關(guān)注[13-14]。近年來，許多科研工作者致力于溶煤菌種選育、溶煤機(jī)理和對溶煤產(chǎn)物的應(yīng)用等方面的研究，在微生物溶煤機(jī)理方面取得了較大的進(jìn)展，形成了被廣泛接受的4大溶煤機(jī)理[15-18]；溶煤產(chǎn)物應(yīng)用方面也有成功的例子，諸如用微生物溶解褐煤制備肥料和土壤調(diào)節(jié)劑[19]，或生產(chǎn)生物可降解塑料[20]。但是，由于煤種的多樣性，導(dǎo)致溶煤條件、菌煤匹配和溶煤產(chǎn)物等方面尚無一定規(guī)律可循，因此，進(jìn)行大量和深入的微生物溶煤實驗探索勢在必行。以內(nèi)蒙古褐煤為研究對象，探討煤樣粒度、氧化程度、溶煤時間和溶煤方式等溶煤條件對溶煤率的影響，利用紅外光譜分析、紫外光譜分析和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析等技術(shù)對溶煤產(chǎn)物與殘煤進(jìn)行分析，研究微生物溶煤產(chǎn)物與溶煤前后氧化煤結(jié)構(gòu)的變化，為進(jìn)一步研究微生物溶煤過程的規(guī)律提供理論依據(jù)。

1實驗材料

11煤樣煤樣采自內(nèi)蒙古四聯(lián)煤礦。先進(jìn)行破碎，篩分為0074～0125 mm，0125～0250 mm和0250～0500 mm 3個粒度，經(jīng)干燥，最后分裝備用。

12菌種選用4種微生物，3種細(xì)菌分別為產(chǎn)堿假單胞菌、施氏假單胞菌和銅綠假單胞菌，1種真菌為粗毛栓菌。除銅綠假單胞菌購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）外，其余3株菌購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。4株菌均采用甘油保藏法保藏于西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院微生物實驗室生化冰箱中。產(chǎn)堿假單胞菌能夠產(chǎn)生堿性物質(zhì)，施氏假單胞菌能夠降解芳烴類物質(zhì)，銅綠假單胞菌能夠分泌表面活性劑鼠李糖脂，粗毛栓菌能夠產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，對木質(zhì)素具有較好的降解能力。以上4株菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì)符合4大溶煤機(jī)理的溶煤條件。

13培養(yǎng)基實驗中4種微生物，產(chǎn)堿假單胞菌與施氏假單胞菌所用培養(yǎng)基相同，為營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基（NB）；粗毛栓菌和銅綠假單胞菌所用培養(yǎng)基分別為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)基組成見表1.

14儀器BL-50A立式壓力蒸汽滅菌器，50 L，022 MPa，最高溫度為135 ℃；BC-360生化培養(yǎng)箱，溫度范圍為0～60 ℃；PE-2400-Ⅱ元素分析儀；KZDL-8B型微機(jī)自動定硫儀；Perkin Elmer GXIV-501傅里葉變換紅外光譜儀；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱，轉(zhuǎn)速50～260 rpm，溫度范圍5～60 ℃；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計；7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS）。

2實驗

21煤樣的制備分別對粒度為0074～0125 mm，0125～0250 mm和0250～0500 mm的內(nèi)蒙古褐煤用6，8和10 mol/L的硝酸進(jìn)行浸泡氧化，48 h后用蒸餾水對其進(jìn)行抽濾，洗凈，直到濾液的pH值接近70為止[21-23]。將不同氧化程度、不同粒度的煤樣經(jīng)立式壓力蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min，然后將煤樣轉(zhuǎn)移至已滅菌的樣品袋中。每次實驗前將樣品袋中氧化滅菌后的煤樣放入70 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重即可。內(nèi)蒙古褐煤原煤與8 mol/L硝酸處理氧化煤的工業(yè)分析與元素分析數(shù)據(jù)見表2.

從表2可以看出，內(nèi)蒙古褐煤的水分與固定碳含量相對較高，分別為1269%和

5132%，C元素含量高，灰分含量與其它元素含量相對較低，屬于低變質(zhì)程度煤。經(jīng)過硝酸氧化預(yù)處理以后，水分、灰分和固定碳含量均降低，揮發(fā)份含量升高，H元素含量降低，N，O元素含量升高，S元素含量降至0.

22菌種的培養(yǎng)將4株菌從安瓿瓶中接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，凍干菌株活性較低，為保證4株菌的純度和活性，需對其進(jìn)行3次復(fù)篩與純化培養(yǎng)[24-27]。將復(fù)篩得到的4株純菌株接種到事先配制好并滅過菌的液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，160 r/min的全溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，備用。

23溶煤實驗

231接種時間

為提高菌株適應(yīng)新環(huán)境的能力，須在其到達(dá)對數(shù)生長期時接入溶煤實驗中，4株菌的生長曲線如圖1所示，產(chǎn)堿假單胞菌、銅綠假單胞菌、施氏假單胞菌與粗毛栓菌生長周期各階段時間見表3.

從圖1和表3可以看出，產(chǎn)堿假單胞菌與銅綠假單胞菌的最佳接種時間為第3天，施氏假單胞菌與粗毛栓菌的最佳接種時間為第4天。

232溶煤率計算溶煤實驗結(jié)束后，過濾，回收殘渣，清洗，烘干稱重，按照公式（1）計算溶煤率[28]。

P=（1-W1W0）×100%.（1）

式中P為微生物溶煤轉(zhuǎn)化率，%；W0為煤樣的初始質(zhì)量，g；W1為煤樣溶解后殘煤的質(zhì)量，g.W0，W1均為空氣氣氛干燥下煤樣的質(zhì)量。

233單因素實驗通過此4株菌與內(nèi)蒙古褐煤的前期溶煤實驗探索，選擇培養(yǎng)基體積為50 mL，菌液接種量為500 mL，煤樣質(zhì)量為050 g，在培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度（30 ℃）和轉(zhuǎn)速（160 r/min）等培養(yǎng)條件相同的情況下，分別改變煤樣粒度（0074～0125 mm，0125～025 mm，025～050 mm）、氧化程度（6 mol/L硝酸氧化、8 mol/L硝酸氧化、10 mol/L硝酸氧化）、溶煤時間和溶煤方式，研究各因素對溶煤率的影響。每批次溶煤實驗設(shè)3組平行試驗，并設(shè)置一組對照試驗，各因素實驗的溶煤率均采用（1）式進(jìn)行計算。234溶煤產(chǎn)物分析在150 mL三角瓶中加入50 mL液體培養(yǎng)基，然后加入粒度為0074～0125 mm，經(jīng)8 mol/L硝酸氧化的煤樣050 g，最后加入處于對數(shù)生長期的菌液500 mL，在30 ℃，160 r/min的全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d.實驗結(jié)束后，過濾，分離溶煤產(chǎn)物，收集殘煤，除掉溶煤產(chǎn)物中的殘余菌絲體，提高其純度，并用蒸餾水對殘煤進(jìn)行清洗，直至殘煤中無菌體殘留，烘干備用。取干燥后的煤樣2 mg與200～400 mg干燥的KBr混合研磨至粉末，放入壓片劑制備成薄片，在450～4 000 cm-1波段下進(jìn)行紅外掃描，分辨率為4 cm-1；以蒸餾水作為參比液，對4株菌的溶煤產(chǎn)物進(jìn)行紫外-可見光譜連續(xù)掃描，掃描波長范圍為190～400 nm；分別用乙酸乙酯、石油醚、丙酮和甲苯對洗煤水與溶煤產(chǎn)物進(jìn)行萃取，萃取產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）分析[29]，氣氛N2，最高溫度300 ℃，氣相色譜柱型為HP-5MS（crosslink 5% PH ME Siloxane，30 m×025 mm i.d.，025 um film thickness），質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為30～500 amu.

3實驗結(jié)果與分析

31煤樣粒度對溶煤率的影響在150 mL三角瓶中加入50 mL液體培養(yǎng)基，然后加入經(jīng)8 mol/L硝酸氧化、已滅菌、3種粒度的煤樣各050 g，最后加入處于對數(shù)生長期的菌液500 mL，在30 ℃，160 r/min的全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d.實驗設(shè)置3組平行試驗，并設(shè)置一組對照試驗。4株菌對3種不同粒度內(nèi)蒙古褐煤的溶煤率見表4.從表4可以看出，4株菌均在煤樣粒度為0074～0125 mm時表現(xiàn)出最好的溶煤效果，同時可見，在煤樣粒度為0074～0500 mm范圍內(nèi)，溶煤率隨著粒度增大而減小。產(chǎn)堿假單胞菌、施氏假單胞菌和銅綠假單胞菌在粒度為0074～0125 mm時的溶煤率分別為3988%，4138%和6026%，明顯高于其它2個粒度的溶煤率。產(chǎn)堿假單胞菌在粒度為0074～0125 mm，0125～0250 mm和0250～0500 mm時的溶煤率分別為3988%，2992%和1951%，變化幅度基本相同。施氏假單胞菌在粒度為0125～0250 mm和0250～0500 mm是的溶煤率相差不大，分別為3007%和2940%，當(dāng)粒度為0074～0125 mm時其溶煤率為4138%，有較大提高；銅綠假單胞菌在粒度為0074～0125 mm時的溶煤率明顯高于產(chǎn)堿假單胞菌和施氏假單胞菌的溶煤率。粗毛栓菌菌絲體的包裹導(dǎo)致其溶煤率較低，但仍符合粒度越大溶煤效果越差的規(guī)律。由此可見，煤樣粒度的大小對生物溶煤率的影響非常大，這是因為煤樣粒度越小其比表面積越大，接觸面積越大，煤樣可被溶解部分暴露在菌液中的面積越大，煤樣與溶煤活性物質(zhì)接觸的概率也就越大，溶煤率越高。

33溶煤時間對溶煤率的影響在150 mL三角瓶中加入50 mL液體培養(yǎng)基，然后加入粒度為0074～0125 mm，經(jīng)10 mol/L硝酸氧化的煤樣050 g，最后加入處于對數(shù)生長期的菌液500 mL，在30 ℃，160 r/min的全溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一天測定一次溶煤率。實驗設(shè)置三組平行試驗，并設(shè)置一組對照試驗。4株菌在不同培養(yǎng)時間下的溶煤率如圖2所示。

從圖2可以看出，在0～14 d內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的增加，4株菌的溶煤率均升高，其中產(chǎn)堿假單胞菌與銅綠假單胞菌能較快適應(yīng)環(huán)境并釋放活性物質(zhì)進(jìn)行溶煤。銅綠假單胞菌與施氏假單胞菌在第10天，產(chǎn)堿假單胞菌與粗毛栓菌在第8天時溶煤率不再升高，溶煤過程基本結(jié)束。從圖2還可以看出，不同菌株在同一時刻的溶煤效果也不同，說明不同菌株的環(huán)境適應(yīng)能力不同，溶煤活性物質(zhì)分泌時間與多少也不同，從而導(dǎo)致溶煤速度不同。溶煤過程結(jié)束后，從圖2中可以明顯看出，各菌株的溶煤能力存在較大差別，其中銅綠假單胞菌的溶煤能力最強(qiáng)，溶煤率達(dá)5922%，由于粗毛栓菌菌絲體會將煤樣包裹其中，導(dǎo)致溶煤能力受到很大影響，溶煤率較低。

34溶煤方式對溶煤率的影響在150 mL三角瓶中加入50 mL液體培養(yǎng)基，然后加入粒度為0074～0125 mm，經(jīng)10 mol/L硝酸氧化的煤樣050 g，最后加入處于對數(shù)生長期的菌液500 mL.分別在30 ℃，160 r/min全溫振蕩培養(yǎng)箱與30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d.實驗設(shè)置3組平行試驗，并設(shè)置一組對照試驗。4株菌在不同培養(yǎng)方式下的溶煤率如圖3所示。

從圖3可以看出，產(chǎn)堿假單胞菌，施氏假單胞菌和銅綠假單胞菌的搖瓶培養(yǎng)溶煤率高于相對應(yīng)靜置培養(yǎng)溶煤率，原因是搖瓶培養(yǎng)時培養(yǎng)基的溶氧率較高，有利于菌株的生長繁殖，同時，搖瓶培養(yǎng)時菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)能夠充分與煤樣接觸，有利于溶煤過程的進(jìn)行；粗毛栓菌搖瓶培養(yǎng)時菌絲體容易將煤樣包裹而靜置培養(yǎng)時煤樣不易被包裹，導(dǎo)致其靜置培養(yǎng)溶煤率高于搖瓶培養(yǎng)溶煤率。

35紅外譜圖分析圖4為氧化煤與4株菌溶煤后殘煤的紅外光譜對照圖，表6為氧化煤與4株菌溶煤后殘煤的紅外譜峰歸屬。從圖4中可以看出，氧化煤與4株菌溶煤后殘煤的紅外光譜整體走勢基本相同。銅綠假單胞菌殘煤峰形最強(qiáng)，峰面積最大，粗毛栓菌殘煤峰形最弱，峰面積最小。結(jié)合圖4與表6，由波數(shù)3 437 cm-1附近的O—H伸縮振動吸收峰可知，氧化煤以及殘煤中存在—OH，并且銅綠假單胞菌殘煤紅外譜圖吸收峰加強(qiáng)，說明溶煤后殘煤中—OH增加；波數(shù)3 130 cm-1附近芳烴的—CH伸縮振動與860 cm-1附近芳烴的—CH彎曲振動顯示，銅綠假單胞菌殘煤中存在芳烴類結(jié)構(gòu)[30]；波數(shù)2 918 cm-1附近存在環(huán)烷烴或者脂肪烴—CH3振動峰；波數(shù)2 352～2 345 cm-1附近存在—COOH振動峰；波數(shù)1 630 cm-1和

1 385～1 352 cm-1附近存在芳環(huán)骨架振動峰，波數(shù)1 060 cm-1附近存在C—O振動峰，波數(shù)541 cm-1附近存在S—S伸縮振動峰。因此，氧化煤與4株菌溶煤后殘煤中均存在醚類結(jié)構(gòu)[28]，溶煤后殘煤中存在苯酚類結(jié)構(gòu)和醚類、羧酸類物質(zhì)。

36紫外譜圖分析圖5為4株菌溶煤產(chǎn)物紫外光譜圖。從圖5可以看出，產(chǎn)堿假單胞菌、施氏假單胞菌、銅綠假單胞菌和粗毛栓菌4株菌溶煤的液體溶煤產(chǎn)物譜圖十分相似，都只有一個明顯的吸收帶。根據(jù)圖中200 nm附近出現(xiàn)的最大吸收峰推測，是由共軛雙鍵中π-π共軛躍遷所引起，確定液體溶煤產(chǎn)物中存在較多不飽和結(jié)構(gòu)，如醛、酮、酸類物質(zhì)；同時，此吸收峰也符合芳香化合物的特征吸收特征，推斷液體產(chǎn)物中存在芳香族物質(zhì)，由此可以說明4株菌溶煤產(chǎn)物中的大分子量芳香類物質(zhì)被溶解為其它不飽和小分子量物質(zhì)。

37氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析圖6為溶煤產(chǎn)物氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析譜圖。圖6中（a）圖為乙酸乙酯萃取GCMS對照圖，（b）為石油醚萃取GCMS對照圖，（c）圖為

丙酮萃取GCMS對照圖譜，（d）圖為甲苯萃取GCMS對照圖。從圖6還可以看出，溶煤產(chǎn)物中有更多化合物被檢出，且這些化合物多為芳香族羧酸或芳香酯，還有部分小分子量烷烴。將檢測出的物質(zhì)進(jìn)行分類，根據(jù)其峰面積計算各類化合物的相對含量，洗煤水與溶煤產(chǎn)物不同萃取方式的分析結(jié)果見表7.

從表7可以看出，當(dāng)萃取劑為乙酸乙酯時，溶煤產(chǎn)物與洗煤水相比，烴類、醇類、醛、酮、醚類和酸類化合物含量降低，酯類化合物含量上升，原因是氧化煤經(jīng)過微生物作用以后部分烴類、醇類、醛、酮、醚類和酸類物質(zhì)被溶解為酯類物質(zhì)，而乙酸乙酯是酯類物質(zhì)，根據(jù)“相似相溶”原理，大部分酯類物質(zhì)被萃取到萃取劑中；當(dāng)萃取劑為石油醚時，溶煤產(chǎn)物與洗煤水相比，烴類、酯類、醇類化合物含量降低，醛、酮、醚類和酸類化合物含量升高；當(dāng)萃取劑為丙酮時，溶煤產(chǎn)物與洗煤水相比，烴類、酯類化合物含量降低，醇類和酸類化合物含量升高，醛、酮、醚類化合物含量幾乎沒有變化；當(dāng)萃取劑為甲苯時，溶煤產(chǎn)物與洗煤水相比，烴類和酸類化合物含量升高，酯類和醛、酮、醚類化合物含量降低，醇類化合物含量不變。因此，經(jīng)過微生物溶解作用后，溶煤產(chǎn)物中烴類、酯類、醇類和醛、酮、醚類化合物含量降低，酸類化合物含量升高；同時，溶煤產(chǎn)物中芳香族化合物減少，低分子量化合物、不飽和化合物增加，說明經(jīng)過微生物的作用，氧化煤中芳香族類大分子量物質(zhì)被部分溶解為其它小分子量物質(zhì)。

4結(jié)論

1）通過單因素實驗得到最佳溶煤條件，當(dāng)采用煤樣粒度為0074～0125 mm，氧化程度為10 mol/L硝酸浸泡處理48 h，溶煤時間為14 d和搖瓶培養(yǎng)的條件進(jìn)行溶煤時溶煤率達(dá)到最高。在此最優(yōu)條件下，銅綠假單胞菌溶煤率最高，達(dá)到6261%；

2）紅外光譜分析結(jié)果顯示，氧化煤與微生物溶解后的殘煤譜圖十分接近，存在—OH伸縮振動峰與苯環(huán)振動峰，說明存在苯酚類物質(zhì)，同時，出現(xiàn)C—O—C振動峰與—COOH振動峰，說明所選內(nèi)蒙古煤中存在醚類和羧酸類物質(zhì)；紫外光譜顯示，溶煤產(chǎn)物中存在苯酚類衍生物、醛類、酮類等物質(zhì)；

3）溶煤產(chǎn)物的GCMS譜圖比洗煤水GCMS譜圖檢出更多化合物，其中多數(shù)為芳香酸或醚類物質(zhì)；且經(jīng)過微生物的溶解作用，溶煤產(chǎn)物中烴類、酯類、醇類和醛、酮、醚類化合物含量降低，酸類化合物含量升高；溶煤產(chǎn)物中芳香族化合物減少，低分子量化合物、不飽和化合物增加，說明原煤中的芳香族類物質(zhì)被部分溶解為其它小分子量物質(zhì)。

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