熱帶假絲酵母菌溶煤培養基的響應面優化

摘要：以熱帶假絲酵母菌對神府煤進行微生物溶煤實驗，依次采用析因實驗、最陡爬坡實驗和響應面分析實驗對溶煤培養基進行優化，并對溶煤產物的紫外可見光譜和紅外光譜進行了分析。結果表明：有機氮源更利于溶煤作用，且最佳氮源為酵母粉；葡萄糖、酵母粉濃度和pH對溶煤作用影響顯著，其最佳水平分別為8.152，15.759 g/L和7.414，此時的響應值A450達最大值14937，溶煤率為23.03%；氧化煤被轉化為深色小分子水溶性物質，與氧化煤的結構相似，溶煤產物中含有醛、酮、羧酸類化合物。

關鍵詞：熱帶假絲酵母菌；微生物溶煤；響應面法

中圖分類號：TQ 536.1

文獻標志碼： A

Abstract：Biosolubilization tests of Shenfu coal were carried out with Candida tropicalis，single factor experiment，steepest ascent experiment and response surface analysis were used to optimize the medium for coal biosolubilization，and then，chemical properties of biosolubilization products were analyzed.Results show that glucose，yeast extract and pH were the most improtant factors that influence the process of biosolubilization，the optimum level of those three variate were 8.152，15.759 g/L and 7.414，respectively，and the maximum response value （A450） reached 14.937 with an coal biosolubility of 23.03%，oxidized coals were transferred into small molecules of watersoluble substances，and the structure of biosolubilization products is similar to oxidized coal，which have aldehydes，ketones and carboxylic acid compounds.

Key words：Candida tropicalis；coal biosolubilization；response surface methodology

0引言

煤是由埋藏在地層下的古代植物殘骸經歷了一系列生物化學和物理化學變化而逐漸形成的，因此，煤中仍或多或少的保留著成煤植物殘體中的木質素和多環芳烴類物質結構[1-2]。微生物溶煤是利用微生物來實現煤中多環芳烴及其脂肪鏈的斷裂、降解，使煤大分子轉化為小分子物質，并最終溶解于水[3-6]。自20世紀80年代有研究者發現一些微生物可將煤溶解為黑色液滴以來，科學工作者對微生物溶煤進行了廣泛的研究，為實現煤的潔凈高效利用開辟了一條可行之路，具有工藝簡單、低能耗、無污染等許多常規處理技術難以比擬的優越性，引起了國內外學者的廣泛關注[7-8]。

隨著微生物溶煤研究的不斷深入，許多科研工作者提出了不同的溶煤機理：堿性溶煤機理[9]、螯合物溶煤機理[10]、表面活性劑溶煤機理[11]、酯酶降解機理[12]和過氧化物酶降解機理[13]等。但無論是何種機理，無外乎是微生物利用培養基中的碳源、氮源、無機鹽、微量元素等營養物質，代謝產生一些無機物或者有機物，而這些物質具有溶解或降解煤的特性。因此微生物溶煤研究中培養基的營養物質種類、含量及比例，不僅影響著微生物的代謝過程和胞外物質的分泌，還對于溶煤效果的高低至關重要[14]。

本實驗利用熱帶假絲酵母菌對神府煤進行微生物溶煤實驗，以液態溶煤所得黑色發酵液在450 nm處的吸光度為響應值，采用單因素實驗篩選出最佳氮源，再利用析因實驗和響應面分析實驗對溶煤培養基進行優化，采用多元二次回歸擬合出方程，從而獲得培養基各營養物質的最佳配比，對含有溶煤產物的黑色發酵液加酸沉淀，獲得溶煤產物，并對溶煤產物進行紫外和紅外光譜分析。

1材料與方法

1.1實驗菌種

實驗所用菌種，熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis，CICC 1463）為球狀真菌，具有較強的降解苯酚和脂肪烴的能力，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），采取甘油保藏法將菌種保存于-4 ℃冰箱中。

1.2煤樣

實驗用煤樣為神府長焰煤，首先將煤粒用圓盤式粉碎機粉碎，再篩分得到不同粒度級的原煤，選擇粒度級為0.045～0.075 mm的原煤進行氧化預處理，獲得實驗所用的氧化煤樣。神府原煤以及氧化煤的工業分析和元素分析見表1.

從表1可以看出神府煤原煤的干燥基灰分為6.03%，干燥無灰基揮發分為38.12%，屬于低灰分、高揮發分煤。經硝酸氧化處理后煤樣灰分顯著降低，揮發分顯著升高，這可能是由于煤樣中的礦物質在酸的作用下分解，并以離子的形式溶解出來，并且煤的大分子在一定程度上被氧化，使低揮發分小分子物質增多，碳含量和氫含量降低，氧含量和氮含量顯著升高。

1.3培養基及培養條件

斜面培養基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，pH自然。30 ℃培養3～5 d.

種子及發酵培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，KH2PO45，pH自然。

培養條件：將復壯后的斜面種子接種于裝有50 mL種子培養基的150 mL三角瓶，30 ℃，搖床轉速180 r/min條件下培養24 h，獲得種子液。以10%的接種量接種裝有0.3 g煤樣和50 mL發酵培養基的150 mL三角瓶，30 ℃，搖床轉速180 r/min條件下培養10 d，離心除去殘煤和菌體，獲得含有溶煤產物的黑色發酵液。

1.4溶煤效果評價

方法一：微生物溶煤后剩余殘煤的質量同起始加入的煤樣質量的差值與起始煤樣質量的比作為煤炭的溶煤率，見公式（1）

η=（m-m1） /m×100%.（1）其中η為微生物溶煤率，%；m為煤樣的起始加入質量，g；m1為煤樣溶解后的殘煤質量，g.

方法二：由于含有溶煤產物的黑色發酵液在450 nm處對可見光的吸光度A450可以間接的反映熱帶假絲酵母菌對神府煤溶煤率的高低[15-16]，并且具有操作簡單，精確性高的優點，故在本實驗中均以A450作為溶煤效果的衡量指標，即文中出現的響應值。

1.5實驗設計

1.5.1單因素實驗設計

采用單因素實驗的方法，考察不同氮源（酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨和硝酸鈉）對熱帶假絲酵母菌溶解神府煤的影響，以確定最佳的氮源。

1.5.2析因實驗設計

熱帶假絲酵母菌溶煤培養基的成分主要有：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和KH2PO4，且pH自然。采用5因素2水平的PlackettBurman實驗設計[17-18]進行析因實驗，經過12次實驗，然后以各因素為自變量，響應值A450為因變量，擬合出線性方程，從而篩選出培養基組成中對溶煤效果影響顯著的因素。

1.5.3最陡爬坡實驗設計

經析因實驗找出主要因素后，根據所擬合的一階模型中各因素系數的正負號及大小來設計顯著因素的最陡上升路徑以及步長，使主要因素同時朝著響應值增大的方向變化，找出峰值，從而逼近最大響應區域。

1.5.4響應面實驗設計

根據BoxBehnken設計[17-18]原理，綜合析因實驗和最陡爬坡實驗結果，以A450為響應值，選取葡萄糖濃度、酵母粉濃度和pH值3種因素作為自變量，并在每種因素的最大響應區域內選取3個合適的水平，運用Minitab 15軟件設計3因素3水平的響應面實驗設計，對實驗數據進行回歸分析，以獲得培養基各營養物質的最佳配比。

1.6溶煤產物分析

含有溶煤產物的黑色發酵液經過濾除菌器（0.22 μm）過濾，進一步除去菌體和懸浮性顆粒后，加酸沉淀，并對沉淀物冷凍干燥，獲得黑色粉末狀的溶煤產物。取干燥的氧化煤和溶煤產物，配制成濃度為50 mg/L的溶液，在TU-1900紫外可見分光光度計上掃描，記錄200～600 nm范圍內吸光度的變化；取干燥的氧化煤和溶煤產物分別與KBr按1∶150的比例混合壓片，用美國Thermo Scientific紅外光譜儀記錄4 000～400 cm-1范圍內的紅外光譜。

2結果與討論

2.1菌種溶煤性質的鑒定

熱帶假絲酵母菌在固體培養基上對神府煤的溶煤效果如圖1所示，可見，平板a中的氧化煤沒有生成黑色液體，培養基也沒有被染成黑色，平板b中只接種了熱帶假絲酵母菌，平板因菌體的出現而呈現出乳白色，平板c中的氧化煤被溶解成液體，并浸潤到固體培養基中，使培養基呈現出黑褐色。這說明氧化煤的微生物溶解并不是由培養基的單獨作用所引起的，而是由于熱帶假絲酵母菌的生命活動產生了某些溶煤活性物質將氧化煤溶解（或降解）為深色的小分子極性物質并溶解于水。

2.2氮源對溶煤的影響

圖2為分別以不同含氮化合物為氮源時，熱帶假絲酵母菌溶煤效果的對比，可知，有機氮源（酵母粉和蛋白胨）對熱帶假絲酵母菌的溶煤過程具有明顯的促進作用（不加煤的發酵液A450為0031），其中酵母粉的促進作用尤為突出，遠遠高于其他幾種氮源，而無機氮源（硫酸銨、硝酸銨和硝酸鈉）對溶煤過程的促進作用極其微弱，和不加煤的發酵液A450幾乎相同，這可能是由于熱帶假絲酵母菌在以酵母粉為氮源的環境中能夠產生更多的溶煤活性物質，促進煤分子結構的改變及在培養基中的溶解。

2.3重要因素的篩選

采用PlackettBurman實驗設計，對培養基中的5個因子：葡萄糖（X1）、蛋白胨（X2）、酵母粉（X3）、KH2PO4（X4）和pH（X5）進行考察，每個因子取高（+1）和低（-1）2個水平，響應值為A450，見表2，各因素所代表的參數水平和方差分析結構見表3.

結果表明，對熱帶假絲酵母菌的溶煤作用具有顯著影響的因素有pH，葡萄糖和酵母粉，其中pH和酵母粉濃度對溶煤作用呈現正效應，葡萄糖濃度則呈現出負效應，這與許多科研工作者所得出的不含葡萄糖的培養基更利于微生物溶煤的結論是一致的。這3個顯著因素對響應值A450的影響可用以下方程表示：Y=1.002 5-0.122 8X1+0.119 2X3+0.622 8X5，方程的決定系數R2=92%，表明該回歸方程擬合良好。由擬合的線性方程可以看出，要提高溶煤效果，應適當提高酵母粉濃度和pH值，降低葡萄糖濃度，其他因子對溶煤效果影響不大在后續的實驗中不再討論。

2.4最大響應區域的逼近

響應面擬合方程只有在接近最優值區域時才近似真實情況，因此要首先逼近此區域才能建立可靠的響應面擬合方程，根據PlackettBurman實驗所篩選出的顯著因子及各因子效應的正負和大小，設計最陡爬坡實驗的爬坡方向及步長，尋找最大溶煤區域。實驗設計及結果見表4，從表4可知最佳溶煤條件在第5組，因此以實驗5所設條件為中心點進行響應面實驗設計。

對實驗結果進行回歸擬合得到多元回歸模型：Y=14.581 3+1.419 8A+0.625 6B+0.797 9C-1.372 8AA-0.740 0BB-0.946 5CC-0.011 0AB-0.888 0AC-0.441 8BC，回歸模型方差分析見表7，系數估計見表8.

由表7知，模型決定系數R2=95.64%，Pr=0.007，表明該模型顯著，回歸方程擬合良好，可用于培養基的優化，從表8可知，葡萄糖，酵母粉和蛋白胨對溶煤作用呈現顯著影響。根據上述回歸方程繪制響應面分析圖及等值線圖，研究葡萄糖，酵母粉和pH這3種因素對A450的影響，其響應面和等值線圖如圖3～5所示。

圖3～5可以直觀的呈現葡萄糖、酵母粉和pH對A450也即溶煤效果的影響，并且可以看出兩兩因素之間存在著明顯的交互作用，最優點落在實驗考察區域內。依據方程的預測結果，當葡萄糖和酵母粉濃度分別達到8.152和15.759 g/L，pH達到7.414時，A450可達最大預測值15.091.

2.6驗證實驗

為了驗證該模型預測的可靠性，采用上述最佳工藝參數進行驗證實驗，經過3次重復實驗得到A450的平均值為14937，與模型預測值接近，表明該模型能很好地預測熱帶假絲酵母菌的實際溶煤情況，且通過重量損失法實際測定該最優條件下的溶煤率為2303%

2.7溶煤產物分析

分析氧化煤和溶煤產物的紫外可見光譜（圖6），可以看出在300～370 nm范圍內均具有較強的吸收峰，此處的吸收峰是與雙鍵相連的雜原子（

CO，CN，NO等）上未成鍵的孤對電子向π*反鍵軌道躍遷產生的R吸收帶，說明氧化煤和溶煤產物中存在含有雜原子、雙鍵π電子的醛、酮羰基或硝基，這可能是由于硝酸氧化以及微生物的作用使氧化煤和溶煤產物中產生了羧酸類、醛酮類或硝化物等化合物。

氧化煤和溶煤產物的紅外譜圖如圖7所示，主要包括以下吸收峰，在3 420 cm-1處有強而寬的吸收，此處寬闊的吸收來源于締合羥基的伸縮振動，在1 300～1 000 cm-1范圍內的眾多吸收峰歸屬于C-O鍵的伸縮振動[15-16]，這兩處吸收峰的出現說明氧化煤和溶煤產物中存在醇、酚和羧酸類含羥基化合物；在2 925和2 850 cm-1處的尖峰歸屬于甲基和亞甲基的C—H伸縮振動，1 380和1 435 cm-1處的吸收峰來源于甲基和亞甲基的C—H面內搖擺振動，這兩處的吸收峰說明氧化煤和溶煤產物中都含有一定的烷烴類結構；在1600 cm-1處的吸收峰歸屬于CO的伸縮振動，說明氧化煤和溶煤產物中含有羧酸類物質；氧化煤和溶煤產物的不同之處在于氧化煤在1 530 cm-1處有一個歸屬于硝基的NO伸縮振動吸收峰，而溶煤產物中沒有，說明氧化煤中的硝基在微生物作用下消失了。通過氧化煤和溶煤產物的紅外譜圖對比可知，與氧化煤中的官能團種類相似，溶煤產物中含有醛、酮、羧酸類等化合物，但氧化煤中官能團更為豐富。

3結論

1）有機氮源對溶煤過程具有明顯的促進作用，其中酵母粉為最佳氮源；

2） pH和酵母粉濃度對溶煤呈現正效應，葡萄糖濃度則呈現出負效應；

3）葡萄糖、酵母粉和pH對溶煤作用具有顯著的影響，其最佳水平分別為8152，15759和7414，此時的響應值A450達最大值，經確認為14937，且此時溶煤率達2303%；

4）紫外可見光譜及紅外光譜分析表明與氧化煤中官能團種類相似，溶煤產物也含有醛、酮、羧酸類等化合物。參考文獻References

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