巨噬細胞移動抑制因子-173G/C基因多態性分布及其與腦梗死關系的研究

袁 寧， 許宏偉， 劉學軍

巨噬細胞移動抑制因子-173G/C基因多態性分布及其與腦梗死關系的研究

袁 寧1，2， 許宏偉1， 劉學軍2

目的 探討巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)-173G/C基因多態性及其與腦梗死關系。 方法 篩選298例腦梗死患者及203例健康人群為研究對象，用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析法檢測MIF基因-173G/C多態性在腦梗死組和正常對照組的基因頻率。結果 腦梗死組和對照組存在MIF基因-173G/C多態性，但MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)。兩種等位基因頻率兩組相比亦無顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)。結論 MIF -173G/C多態性可能與腦梗死發生無關，G/C等位基因可能不是腦梗死發病的獨立危險因素。

腦梗死； 巨噬細胞移動抑制因子； 基因； 多態性

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)于1966 年分別由Bloom和David兩組科學家在用豚鼠進行遲發性超敏反應研究中發現，是機體內一種重要的細胞因子。其能促進巨噬細胞在炎癥局部的聚集、增生、活化，增強其粘附、吞噬作用，促進分泌一些細胞因子，如IL-1、TNF-a、NO等，從而間接增強巨噬細胞的功能，并能抵消皮質類固醇激素對其它炎癥細胞因子產生的免疫抑制作用，在機體的全身和局部炎癥及免疫反應中起著重要的作用[1]。而炎癥反應在動脈粥樣硬化從起始發病到出現臨床事件都發揮重要作用的認識已獲得廣泛認同，研究表明：血管發生動脈粥樣硬化部位的MIF表達水平明顯上調，且隨著斑塊的發展逐漸上升；相反，阻斷MIF的表達則可以顯著延緩動脈粥樣硬化的發展并穩定斑塊。盡管發現MIF在多種炎性疾病和動脈粥樣硬化患者組織和血液中表達變化，但對于其基因多態性與健康人及患者中MIF表達的關系認識卻很少。本文就MIF -173G/CSNPS與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系展開研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集腦梗死患者298例，平均年齡(64.48±11.48)歲，經臨床及 CT和(或)磁共振成像(MRI)確診(依照第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準)，排除心律失常、動脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等引起的腦出血；排除肝、腎疾病、自身免疫性疾病、妊娠者、半年內曾有降脂治療者。對照組為健康體檢者共203例，平均年齡(61.27±7.80)歲，無血緣關系。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物 MIF -173G/C的PCR引物參照文獻[2]，序列為PCR1：上游引物：5’-ACT-AAG-AAA-GAC-CCGAGGC-3；下游引物：5’-GGG-GCA-CGTTGG-TGT-TTA-C-3’；上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 DNA的制備及PCR擴增，基因型分析 (1)基因組 DNA的制備：采外周靜脈血 2～3 ml用明膠沉淀紅細胞，提取白細胞后用酚/氯仿抽提基因組DNA。(2)目的基因的 PCR擴增：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環，72 ℃充分延伸10 min。最后置于4 ℃終止反應。(3)PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，凝膠電泳成像分析系統內觀察(4)酶切產物識別：MIF-173G/C多態性由內切酶Alu I識別，37 ℃消化10 h。然后均用瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳分離，紫外燈下照相后閱讀。

1.3 統計學分析 全部資料均用SPSS 13.0 for windows軟件包進行數據處理。

研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗，并以比值比(OR)和95%可信區間(CI)表示相對風險度。計量資料指標均進行正態性檢驗，符合正態分布者組間比較用t檢驗，3組及3組以上比較用方差分析；不符合正態分布數據采用非參數檢驗。所有的統計檢驗均為雙側概率檢驗，以P<0.05為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 腦梗死組與對照組的臨床數據比較 將腦梗死組患者與對照組進行一般數據的比較，兩組在年齡、性別、吸煙史、飲酒史方面均無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

表1 腦梗死組與對照組的一般數據比較

注：*代表與對照組相比P<0.05

2.2 MIF-173G/C 多態位點PCR產物酶切圖譜分析 MIF-173G/C多態位點可被限制性內切酶Alu I識別。酶切后產生三種基因型：純合子 GG、CC，雜合子 GC(見圖1、圖2)。

2.3 MIF-173G/C基因多態分布 CI組和對照組都有GG、GC、CC三種基因型，在研究總人群中(CI組+對照組)中的頻率分別為：62.28%，32.73%，4.99%；等位基因G、C的頻率分別為78.64、21.36。按Hardy-Weinberg平衡定律對研究人群進行了平衡檢驗(P>0.05)，證明我們選擇的總研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。

因CC基因型與GC基因型數量較少，將之合并為C等位基因攜帶者組，組間比較結果顯示：MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)。兩種等位基因頻率兩組相比亦無顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)(見表2)。

M：100 bp Maker，1-5泳道是PCR擴增產物

1、2雜合子GC型；3純合子CC型；4、5、6、7純合子GG型

3 討 論

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是巨噬細胞自分泌的一種重要的前炎癥因子。巨噬細胞不僅是產生MIF的主要細胞，也是MIF作用的靶細胞。MIF可能廣泛參與了機體多種生理及病理生理學反應，包括炎癥反應、免疫調節、脂肪發生、腎臟病變、腫瘤生成和皮膚創傷修復等。國內李敬[3]、劉運涌[4]發現MIF水平與動脈粥樣硬化斑塊的穩定性有關，李歸宿[5]發現腦梗死患者MIF水平減低，且MIF水平高低與 動脈粥樣硬化患者病情輕重、梗死灶體積大小密切相關。另有作者[6～8]發現在阿爾茨海默病、血管性癡呆、腔隙性腦梗死患者基線期、隨訪期患者中MIF水平均高于正常對照，認為其可以作為老年癡呆早期診斷和認知損傷程度判斷的敏感指標。

表2 CI組與對照組MIF-173G/C基因型頻率和等位基因頻率比較

注：CI=腦梗死組，括號內表示各亞組例數在總人數中的比例。與對照組相比，P>0.05

多種研究證實MIF基因-173G/C多態性與阻塞性呼吸睡眠暫停[9]、膀胱癌[10]、風濕性關節炎[11]等多種疾病相關。本研究發現MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)，兩種等位基因頻率兩組相比亦無顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)。下一步我們將對MIF-173G/C多態性與血糖、血脂代謝展開深入研究。目前對MIF-173G/C多態性研究結果不盡一致。Tereshchenko等[12]對捷克和俄羅斯的 459位心肌梗死患者，311位健康對照組進行了基因分型，發現該位點在病例組和對照組分布沒有顯著差別，但女性心肌梗死患者的GG基因型明顯高于女性對照組，與冠心病存在相關性(P=0.027)。Herde[13]一項對德國人長達18 y的病例對照研究發現MIF-173G/C多態性和血清MIF 蛋白水平及2型糖尿病的發生無顯著相關性。我們認為不同研究結果的差異可能與試驗人群的差異包括飲食、環境和方法學的因素有關，當然與抽樣誤差、樣本量大小等也有關聯。

本研究首次報道MIF-173G/C基因多態性分布及其與腦梗死的關系，通過研究我們未見MIF-173G/C基因多態性與腦梗死有關，G/C等位基因不是腦梗死發病的獨立危險因素。

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Relationship between MIF-173G/C single nucleotide polymorphism and atherosclerotic cerebral infarction.

YUANNing，XUHongwei，LIUXuejun.

(XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

Objective To study the relationship between MIF -173G/C single nucleotide polymorphism(SNPS) and atherosclerotic cerebral infarction(CI). Methods The genotypes for the tested MIF SNPs were detected by polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and DNA sequence. Results There existed -173G/C polymorphism of MIF in CI patients and controls，however，no significant differences were observed in genotypes and allele frequencies between CI patients and controls for MIF-173G/C polymorphism(P>0.05). Conclusion MIF-173G/C polymorphism has no significant correlation with CI patients and allele G/C isn’t an independent risk factor for CI.

Cerebral infarction； Macrophage migration inhibitory factor； Gene； Polymorphism

2016-11-20；

2017-02-13

(1.中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008；2.湖南省腦科醫院，湖南 長沙 410007)

劉學軍，E-mail：707151907@qq.com

1003-2754(2017)03-0247-03

R743

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