尤瑞克林對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎性反應的影響

蔣 鋒， 山 媛， 王 莉， 崔小麗， 王曉輝， 王 樂

尤瑞克林對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎性反應的影響

蔣 鋒， 山 媛， 王 莉， 崔小麗， 王曉輝， 王 樂

目的 研究尤瑞克林對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后炎性反應的影響。方法 將90只SD大鼠隨機分為3組：假手術組，對照組，治療組。采用線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型，缺血2 h后，拔出線栓，恢復灌注24 h，觀察大鼠神經功能缺損癥狀、腦梗死體積、腦組織中白細胞浸潤、MPO活性、IL-1和ICAM-1的表達。結果 (1)假手術組大鼠在神經功能缺損評分、腦梗死體積均低于對照組，有顯著的統計學差異(P<0.01)；腦組織中白細胞浸潤程度、髓過氧化物酶(MPO)活性、ICAM-1和IL-1的表達均較對照組低，統計學差異明顯(P<0.01)；(2)治療組與對照組相比，大鼠的神經功能缺損評分低、腦梗死體積小，有顯著統計學差異(P<0.01)；白細胞浸潤程度、MPO活性、ICAM-1和IL-1的表達均較對照組減少(P<0.01)。 結論 尤瑞克林可通過抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎性反應來實現其神經保護作用。

腦缺血； 尤瑞克林； 髓過氧化物酶； 白介素-1； 細胞間粘附分子-1

腦缺血再灌注損傷，是指腦組織缺血一定時間后再恢復血液灌注，腦組織細胞損傷反而進一步加重，成為臨床治療的重點，發生機制非常復雜，目前認為存在多種因素[1，2]，在缺血缺氧情況下腦組織過度炎癥反應，產生大量代謝毒素，進一步加重腦組織損傷[3，4]。本實驗通過觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎性反應，探討尤瑞克林在腦缺血再灌注損傷中的腦保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥方式 選擇健康雄性SD大鼠90只，體重250～300 g(西安交通大學醫學院動物中心提供)，隨機分為3組，每組30只：假手術組，對照組，治療組。治療組于造模成功后30 min舌下靜脈一次性注射用滅菌0.9%氯化鈉溶液稀釋的尤瑞克林8.75×10-3PNAU/kg，給藥體積1 ml/kg[5]。假手術組和對照組分別以相同的方法給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/kg。

1.2 動物模型制作 大腦中動脈閉塞再灌注(MCAO/R)模型制作采用改良的Longa法。即解剖分離暴露頸部血管，采用線栓法短時間栓塞左側大腦中動脈，2 h后拔出栓線，恢復缺血腦區的血液灌注，建立MCAO/R模型，再灌注24 h后取腦組織。假手術組只解剖分離暴露頸部血管，不插入栓線。

1.3 大鼠神經神經功能缺損評分 參考Longa FZ 等5級評分法，0分：無神經功能缺損癥狀；1分：提尾時對側前肢不能完全伸直；2分：向病灶對側轉圈征象；3分：向病灶對側傾倒；4分：不能自發行走及意識喪失。

1.4 TTC染色、腦梗死體積計算 各組隨機選10只大鼠，10%水合氯醛深度麻醉后斷頭處死，完整取出鼠腦，將腦組織切片，行TTC染色，后將腦片轉至100 g/L甲醛液中，冰箱冷藏固定24 h。取出后數碼相機照相，將染色結果輸入計算機，利用圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0計算：梗死區體積(%)=梗死區體積/缺血側的總體積。

1.5 免疫組化和生化檢測 每組隨機各選10只大鼠，10%的水合氯醛過量腹腔注射麻醉，迅速剪開胸腔，暴露心臟，經升主動脈插管后，先用200 ml的生理鹽水快速沖洗，然后用4 ℃ 4%多聚甲醛500 ml(先快后慢)繼續灌注內固定至少1.5 h。斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，包埋成蠟片，免疫組化染色后，在高倍鏡下觀察腦組織中白細胞數、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)陽性血管數、白介素-1(IL-1)陽性細胞數。

每組剩余10只，取腦組織后用生理鹽水制成20%的腦組織勻漿，取0.45 ml 20%的組織勻漿，按照試劑說明書，采用紫外分光光度計比色法用于測定髓過氧化物酶(MPO)。

2 結 果

2.1 大鼠神經功能缺損評分 在大鼠處死時間點前評分，除假手術組，其他兩組均出現了不同程度的神經功能缺損癥狀。治療組大鼠神經功能缺損評分均低于對照組(P<0.01)(見表1)。

2.2 大鼠腦梗死體積 由TTC染色結果可見，假手術組腦片全部呈紅色，對照組和治療組大鼠缺血側額頂葉皮質及紋狀體區可見明顯的白色梗死灶，治療組梗死體積明顯小于對照組(P<0.01)(見表2，圖1)。

2.3 大鼠腦組織中MPO的活性 用比色法檢測腦組織MPO活性，對照組明顯高于假手術組(P<0.01)；治療組中MPO的活性明顯下降，與對照組相比差異顯著(P<0.01)(見表3)。

2.4 大鼠腦組織中白細胞浸潤，ICAM-1和IL-1表達 腦組織中的白細胞數、ICAM-1陽性血管數、IL-1陽性細胞數，對照組明顯高于假手術組(P<0.01)，治療組與對照組相比明顯減少，有顯著統計學差異(P<0.01)(見表4)。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分(mean rank)

#P<0.01 vs假手術組；*P<0.01 vs對照組

表2 各組大鼠腦梗死體積±s)

#P<0.01 vs假手術組；*P<0.01 vs對照組

表3 各組大鼠腦組織MPO的活性±s)

#P<0.01vs假手術組；*P<0.01vs對照組

表4 大鼠腦組織中白細胞、ICAM-1、IL-1的含量

#P<0.01 vs假手術組；*P<0.01 vs對照組

假手術組 對照組 治療組

圖1 各組大鼠腦梗死病灶(TTC染色)

3 討 論

腦梗死是神經系統常見疾病，具有發病率、致死率、致殘率、復發率高的特點，主要由于血管堵塞導致腦血流減少而引起腦損傷，腦缺血時間越長，腦損傷越重，預后越差，如果腦血流很快恢復，則損傷可逆，缺血半暗帶內的神經細胞仍可恢復正常[6，7]，盡早恢復腦血流，挽救缺血半暗帶是早期治療的關鍵，但改善血流后所引起的缺血再灌注損傷常是治療的重點，也是臨床研究的熱點。其發生機制與炎癥反應、氧自由基增多、鈣超載、神經元凋亡等有關，其中炎癥反應在促進缺血半暗帶轉為梗死區的過程中發揮著重要作用[8]，炎性反應的標志是白細胞浸潤和小膠質細胞、星型膠質細胞的激活[9，10]，膠質細胞主要引起細胞免疫，可誘導大量炎性介質釋放[11]，其中主要包括IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)等。白細胞的浸潤、遷移、聚集是炎癥反應的重要環節，炎癥反應的主要細胞是中性粒細胞和單核巨噬細胞，MPO存在于中性粒細胞的嗜天青顆粒中，其活性是判斷中性粒細胞浸潤程度的可靠指標[12]。在腦缺血發生后，白細胞被活化，活化的白細胞向缺血區域遷移，并釋放多種炎性介質和炎性趨化因子，加速了白細胞的聚集、遷移。其中微血管內皮細胞受到損傷，ICAM-1表達增強，引起白細胞和內皮細胞相互反應，促使白細胞粘附于內皮細胞，然后穿越內皮，浸潤缺血腦組織[13]。IL-1對白細胞有趨化作用，中樞神經系統內細胞均可表達IL-1[14]，但過量的IL-1表達，促使大量的白細胞向缺血區浸潤，聚集，放大了炎癥級聯反應，并可通過鈣離子超載、NO、上調細胞凋亡基因加重腦損傷。

尤瑞克林是國家一類新藥，治療急性期腦梗死的用藥，成份為人尿激肽原酶，是激肽釋放酶-激肽系統的一個正向調節物質，能選擇性擴張腦缺血部位細小動脈，增加缺血腦組織血流量，促進缺血區新生血管生成，減輕炎癥反應，有減少神經細胞和神經膠質細胞凋亡等神經保護作用[15]。在本研究發現，腦缺血再灌注后，腦組織的炎性反應明顯加重，治療組給與尤瑞克林干預后，明顯抑制了白細胞浸潤程度、MPO活性、ICAM-1和IL-1表達，減少了腦梗死的體積，改善神經功能缺損癥狀，由此推測尤瑞克林發揮其神經保護作用的部分機制是通過抑制腦缺血再灌注損傷后的炎性反應來實現的。

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Influence of inflammatory response from Urinary Kallidinogenase after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

JIANGFeng，SHANYuan，WANGLi，etal.

(NeurologyDepartmentⅠofShaanxiProvincePeople’sHospital，Xi’an710061，China)

Objective To investigate influence of inflammatory response from Urinary Kallidinogenase after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods 90 SD rats were randomly divided into three groups：sham operation group，control group and treatment group. The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was established by thread embolism method. After 2 h，the plug was pulled out of the 24 h，to observe the symptoms of neurological deficits，infarct volume，leukocyte infiltration，MPO activity，IL-1 and ICAM-1 expression in brain tissue of rats. Results First，The the volume of cerebral infarction and the neurological deficit scores in sham operation group were lower than the control group. There was a statistically significant difference(P<0.01). The degree of leukocyte infiltration，MPO activity，ICAM-1 and IL-1 expression in brain tissue were lower than those in control group，statistically significant difference(P<0.01). Second，Comparing comparing with the control group，the neurological deficit scores of rats and the cerebral infarction volume were smaller in the treatment group，with significant difference(P<0.01). In the treatment group，the degree of leukocyte infiltration and the activity of MPO，ICAM-1 and IL-1 expression decreased compared with the control group(P<0.01). Conclusion The neuroprotective effect of Urinary Kallidinogenase can be achieved by inhibiting the inflammatory response after cerebral ischemia reperfusion injury in rats.

Cerebral ischemia； Urinary Kallidinogenase； MPO； ICAM -1； IL -1

2016-11-05；

2017-02-26

(陜西省人民醫院神經內一科，陜西 西安 710061)

蔣 鋒，E-mail：docjiangfeng@163.com

1003-2754(2017)03-0262-03

R743

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