不同濃度Aβ25-35蛋白模擬阿爾茨海默病模型學習記憶的差異

王 凱，李 強，孫偉明，徐家淳，郭 威，曹 楊，周 震*

(1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150)

研究報告

不同濃度Aβ25-35蛋白模擬阿爾茨海默病模型學習記憶的差異

王 凱1，李 強2，孫偉明1，徐家淳1，郭 威1，曹 楊1，周 震2*

(1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300150)

目的 不同濃度的淀粉樣蛋白Aβ25-35側腦室注射后，觀察大鼠Morris水迷宮學習記憶能力的變化，探討制備AD模型大鼠時Aβ25-35注射的最佳濃度。方法 雄性SD大鼠隨機分為假手術組和模型組，模型組Aβ25-35注射濃度分別為2、4和8 μg/μL。參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選取右側側腦室注射聚集態的Aβ25- 35，制備AD大鼠模型。造模成功后7 d采用Morris水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力的變化。結果 平均游泳速度比較，各組大鼠間差異無顯著性(P> 0.05)。逃避潛伏期結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期時間明顯增加，差異有顯著性(P< 0.05)；模型組中，與注射2 μg/μL的大鼠比較，注射4 μg/μL與8 μg/μL后大鼠逃避潛伏期時間明顯增加，差異有顯著性(P< 0.05)；4 μg/μL與8 μg/μL組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)。目標象限的活動時間與路程顯示，與假手術組比較，模型組注射不同劑量Aβ25-35的大鼠目標象限活動時間和路程均顯著減少，差異有顯著性(P< 0.05)，但模型組不同濃度間比較差異無顯著性(P> 0.05)。空間探索結果顯示，與假手術組比較，模型組注射不同劑量Aβ25-35的大鼠穿越平臺次數均顯著減少，差異有顯著性(P< 0.05)；模型組中，與注射2 μg/μL的大鼠比較，注射4 μg/μL和8 μg/μL后大鼠穿臺次數明顯減少，差異有顯著性(P< 0.05)。4 μg/μL與8 μg/μL組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)。結論 單側側腦室注射Aβ25-35蛋白制備大鼠AD模型時，注射Aβ25-35的推薦濃度為4μg/μL。

Aβ25-35；阿爾茨海默病；Morris水迷宮；行為學；學習記憶能力

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以學習記憶障礙為主的常見中樞神經系統退行性疾病。其主要病理特征包括β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑、Tau蛋白異常磷酸化形成的神經纖維纏結以及神經元的丟失[1]。研究發現Aβ是AD病理改變的核心與啟動因素[2, 3]。故近10多年來，大量關于AD的基礎研究都采用了腦內注射Aβ建立動物模型[4]。然而在眾多報道中Aβ的配置濃度多樣，參考實驗時存在較難取舍的問題。因此，本研究擬通過大鼠側腦室注射不同濃度的Aβ25-35制備AD模型，采用Morris水迷宮觀察其學習記憶能力的變化，通過行為學比較得到注射建模時Aβ25-35的最佳濃度。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性SD大鼠36只，SPF級，體重200 g左右，購自維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2012-0001】。

1.2 藥物及試劑

Aβ25-35(sigma公司，規格1mg，純度 > 97%，批號：053M4804V)溶于生理鹽水配制成濃度為2、4和8 μg/μL，置于37℃無菌恒溫箱內孵育96 h，凝聚后4℃存用[5]。

1.3 儀器

腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)；Topscanlite動物運動軌跡記錄分析系統(北京吉安得爾科技有限公司)；10 μL微量進樣器(上海高鴿工貿有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及模型制備

將36只大鼠隨機分為假手術組和模型組，假手術組6只，模型組注射Aβ25-35濃度分別為2、4和8 μg/μL，每組各10只。

10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，將大鼠頭部固定在腦立體定位儀上，保持前后囪同一水平，備皮，碘伏消毒，頭頂部正中切口，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進行定位，在前囟點后1.5 mm，中線右側旁開1.0 mm，用三棱針鉆一小孔，垂直插入微量注射器，深度為4.0 mm(可達側腦室)。緩慢注射5 μL(1μL/min)聚集態的Aβ25-35溶液，注射持續約5 min，留針5 min，使Aβ充分彌散，緩慢出針(耗時5 min)。骨科蠟封堵鉆孔，雙氧水消毒皮緣，常規縫皮。假手術組經同樣操作，僅向側腦室注入5 μL生理鹽水。術后各組大鼠再連續予腹腔注射青霉素，每只4萬U，連續3d，預防感染，7 d后進行行為學檢測。

1.4.2 Morris 水迷宮檢測

水迷宮裝置由一黑色圓柱型水池和一可移動位置的站臺組成。水池高60 cm，直徑150 cm，站臺直徑10 cm，水池上空通過一個數字攝相機與計算機相連接。在水池中注入清水，水深23 cm，加入食用黑色素使池水變為不透明的黑色，站臺表面為黑色，水面高出站臺表面2 cm。水溫控制在(25±1)℃。

定向航行實驗：檢測持續5 d，每天4次，每次分別隨機從不同象限將大鼠腹側朝向桶壁放入水，每次入水間隔1 min。設定時間為90 s，若動物在90 s內找到站臺，讓其在站臺上停留10 s，若動物未找到站臺，將其引導至站臺上，使其停留10 s，攝像頭追蹤大鼠至其上隱藏跳臺或耗時90 s終止記錄。

空間探索實驗：檢測第6 天撤除隱藏跳臺，選擇同一象限放入各組大鼠，記錄越平臺區域次數。

1.4.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

實驗注射過程中，模型組中8 μg/μL組共有3只動物死亡，解剖后死因未明，考慮與注射濃度過高有關。實驗結束醒轉后，各組大鼠活動自如，至水迷宮檢測前模型組4 μg/μL組共有2只動物死亡，解剖后發現死于肺炎或腸梗阻，詳見表1。

表1 各組動物死亡情況

2.2 平均游泳速度

水迷宮檢測不同組間大鼠平均游泳速度比較，各組間差異無顯著性(P> 0.05)。說明各組大鼠間體質無明顯差異，詳見表2。

表2 各組大鼠平均游泳速度比較

2.3 定位航行試驗

2.3.1 逃避潛伏期

隨著訓練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期在不斷縮短。假手術組大鼠第1 天時間稍少于其他組，從第2天開始，逃避潛伏期時間明顯減少，第4 ～ 5 天逃避潛伏期趨向于平穩。注射不同劑量Aβ的大鼠第1 天逃避潛伏期時間要高于假手術組，且隨著注射劑量的增加，逃避潛伏期有明顯的延長，從第2 ～ 5 天，逃避潛伏期逐漸減少。

各組大鼠逃避潛伏期時間進行廣義估計方程分析，組別之間存在差異(P= 0.015)，組別×時間未見交互效應。從各組大鼠逃避潛伏期時間邊界均值來看，其逃避潛伏期時間假手術組 < 2 μg/μL組 < 4 μg/μL組 < 8 μg/μL組，表明隨著注射Aβ劑量的增加，大鼠的空間學習記憶能力明顯減低。與假手術組比較，其他組大鼠逃避潛伏期時間明顯增加，差異有顯著性(P< 0.05)；與2 μg/μL組大鼠比較，4 μg/μL組與8 μg/μL組逃避潛伏期時間明顯增加，差異有顯著性(P< 0.05)；與4 μg/μL組比較，8 μg/μL組逃避潛伏期時間雖然有增加，但是差異無顯著性(P> 0.05)，詳見表3、表4，表5。

2.3.2 目標象限活動時間

不同組別目標象限活動時間比較。與假手術組相比，注射2、4、8 μg/μL組大鼠目標象限活動時間有明顯的降低(P< 0.05)；2 μg/μL組、4 μg/μL組、8 μg/μL組之間比較，組間差異無顯著性(P> 0.05)，詳表6。

2.3.3 目標象限路程

不同組別目標象限路程比較。與假手術組相比，2、4、8 μg/μL組大鼠目標象限路程顯著減少(P< 0.05)；2 μg/μL組、4 μg/μL組、8 μg/μL組之間比較，組間差異無統計學意義(P> 0.05)，詳表7。

2.4 空間探索試驗

不同組別Morris水迷宮穿越平臺次數比較，與假手術組比較，2、4、8 μg/μL組穿越平臺次數均有顯著減少(P< 0.05)；與2 μg/μL組比較，4、8 μg/μL組穿越平臺次數顯著減少(P< 0.05)；而4 μg/μL組與8 μg/μL組比較，差異無顯著性(P> 0.05)，詳見表8。

表3 各組大鼠逃避潛伏期時間比較

表4 廣義估計方程模型效應檢驗

表5 各組逃避潛伏期時間邊界均值

表6 各組大鼠目標象限活動時間比較

注：vs假手術組，*P< 0.05。

Note.*P< 0.05, vs. the sham operation group.

表7 各組大鼠目標象限路程比較

注：vs假手術組，*P< 0.05。

Note.*P< 0.05, vs. the sham operated group.

表8 各組大鼠穿越平臺次數比較

注：vs 假手術組，*P< 0.05；vs 2 μg/μL組，#P< 0.05。

Note.*P< 0.05, vs. the sham operated group.#P< 0.05,vs. the 2 μg/μL group.

3 討論

隨著人口老齡化速度的加快，AD的患病人數逐年上升，其發病進程與臨床癥狀給社會和家庭均帶來了極大的經濟及救治負擔。因此，防治AD已成為我國亟待解決的公共和衛生問題。為了更好的研究AD的發病機制和有效治療藥物的作用機制，良好的模型制備是必不可少的。雖然AD的發病機制目前尚不明確，但Aβ的聚集是AD發生和發展的關鍵因素[6]。腦內發揮毒性作用的Aβ主要分為Aβ1-40和Aβ1-42兩種。本研究中所用的Aβ25-35為人工合成，但代表了體內蛋白酶分解APP(amyloid precursor protein，APP)產生Aβ蛋白過程中的最短Aβ片段，且幾乎與Aβ1-42具有同等的毒性作用[7]。目前圍繞Aβ的毒性作用，轉基因動物模型是研究AD的熱點，但同樣也存在造模程序復雜，制備費用昂貴和傳代缺乏穩定性[8,9]的不足。因而采用具有神經毒性的Aβ片段注射到大鼠側腦室、基底核或海馬等部位以模擬AD發病的動物模型同樣得到廣泛應用。本團隊既往研究發現，采用側腦室注射Aβ25-35可造成大鼠學習記憶能力減退，海馬神經元丟失和突觸超微結構損傷[10, 11]，其中配置合理濃度的注射用Aβ是實驗成功的先決條件。

Morris水迷宮是目前公認的評價大鼠行為學的方法。該實驗原理表明：大鼠可在短時間訓練后出于本能在水箱中搜尋到藏匿于水下的逃避平臺。利用水迷宮以外的結構線索找到平臺所在位置的過程，需要海馬體主要負責學習和記憶存儲。整個過程涉及到空間定位相關的視覺信息的收集，處理加工再整理，記憶和取出等復雜環節。該檢測方法主要用來考察大鼠的空間記憶、工作記憶和空間鑒別能力。針對水迷宮的統計方法一般多選用重復測量方差分析，但是重復測量方差分析要求數據格式比較嚴格，一般情況下，數據離散度較大，正態性比較差，本次實驗研究應用GEE(廣義估計方程)統計方法進行數據處理，GEE為半參數估計方法，適用于存在缺失值且正態性差的數據，能夠更好的評估數據的error(標準誤)和靈活的選取協方差結構，因此本次數據分析選用GEE進行分析。

本次實驗研究結果表明：手術后各組間大鼠平均游泳速度比較，組間無顯著差異，說明注射對各組間大鼠的體質無顯著影響。定位航行試驗顯示，隨著訓練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期不斷縮短。注射不同劑量Aβ25-35的大鼠逃避潛伏期時間明顯高于假手術組，且隨著注射劑量的增加，逃避潛伏期有明顯的延長，其中4 μg/μL組效果更為明顯。目標象限活動時間和路程顯示，與假手術組比較，注射不同劑量Aβ25-35的大鼠目標象限活動時間和路程均顯著減少。空間探索試驗發現，與假手術組比較，注射不同劑量Aβ25-35的大鼠穿越平臺次數顯著減少，且較2 μg/μL組，4 μg/μL和8 μg/μL組減少更為顯著。提示單側側腦室注射Aβ25-35能夠成功制備大鼠AD模型，綜合上述實驗結果并結合模型的穩定性和死亡率考慮，注射Aβ25-35的推薦濃度與體積為4 μg/μL和5μL。

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Aβ25-35protein in different concentrations to create a rat model resembling Alzheimer’s disease and the differences in their learning and memory ability

WANG Kai1, LI Qiang2, SUN Wei-ming1, XU Jia-chun1, GUO Wei1, CAO Yang1, ZHOU Zhen2*

(1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;2. The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150)

Objective To observe the learning and memory ability of rats after injection of Aβ25-35protein in different concentrations into the lateral ventricle assessed by Morris water maze test, and to explore the optimal concentration of Aβ25-35in the preparation of AD model rats. Methods Male SD rats were randomly divided into sham operated group and model group. The rats of model group received Aβ25-35injection in concentrations of 2 μg/μL, 4 μg/μL and 8 μg/μL, respectively. According to theRatBrainStereotaxicAtlas, 5 μL of aggregation of Aβ25-35was injected into the right lateral ventricle to establish the AD rat model. 7 days after successful modeling, Morris water maze was used to test thechanges of learning and memory ability of the rats. Results There was no significant difference in the average swimming speed between the two groups (P> 0.05).The escape latency time of rats in the model group was significantly increasedcompared with the sham group (P< 0.05).In the model group, the escape latency time of rats treated with 4 μg/μL and 8 μg/μL Aβ25-35was significantly increased compared with the rats injected with 2 μg/μL (P< 0.05), while there was no significant difference between rats treated with 4 μg/μL and 8 μg/μL Aβ25-35(P> 0.05). The activity time and distance of target quadrant of the rats injected with different concentration of Aβ25-35in the model group were significantly reduced compared with the sham group (P< 0.05), but no significant difference amongthe rats treated with different Aβ25-35concentrations (P> 0.05). Compared with the sham-operated group, the number of platform-crossing of rats injected with different doses of Aβ25-35in the model group were significantly reduced (P< 0.05). In the model group, the rats treated with 4 μg/μL and 8 μg/μL was significantly reduced compared with the group with 2 μg/μL injection (P< 0.05). There was no significant difference between the rats injected with 4 μg/μL and 8 μg/μL (P> 0.05). Conclusions The recommended dose and concentration of Aβ25-35to be injected into the unilateral ventricle to establisha rat model of Alzheimer’s disease is 4 μg/μL in a volume of 5 μL.

Aβ25-35protein; Alzheimer’s disease; Morris water maze test; Behavior; Learning and memory ability

高等學校博士學科點專項科研基金(20131210110012)；國家自然基金(81273940)。

王凱，博士研究生，研究方向：中醫腦病方向。E-mail：wangkai19881023@163.com

周震，醫學博士，主任醫師，碩士研究生導師，從事中西醫結合防治腦病工作。E-mail：zhouzhen7681@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0014-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.003

2016-08-19