轉2mG2-epsps基因水稻種子蛋白質非預期變異分析

李燕燕 趙 艷

（浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310018）

轉2mG2-epsps基因水稻種子蛋白質非預期變異分析

李燕燕 趙 艷

（浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310018）

以轉2mG2-epsps基因抗草甘膦水稻為材料，根據實質等同性原則，分析轉基因（genetically modified，GM）水稻種子可溶性蛋白含量和組分的非預期變異。結果表明：與非轉基因親本相比，GM水稻種子的總可溶性蛋白含量極顯著降低，主要受谷蛋白含量變異影響。但清、球、醇、谷4種蛋白含量的最高變異幅度（9.12%）低于P1和P2兩親本之間的最大差異幅度（14.67%）。說明GM水稻種子的可溶性蛋白含量非預期變異在安全范圍內，但營養品質可能與親本品系存在差異。SDS-PAGE分析發現，GM水稻株系T12和T22分別有12和14個蛋白譜帶發生了非預期變異，涉及4種可溶性蛋白的組分，多數表現為含量變化。突出的是，2個GM水稻株系中均新增加了41 ku和56 ku谷蛋白組分，需要進一步通過毒理學分析評價其食品安全性。

轉基因水稻 種子可溶性蛋白 實質等同性 非預期變異

水稻作為全球最重要的農作物，近年來面積和單產的增長率逐年變小，病蟲草害和自然災害頻發是主要的誘因［1］，雜草稻與水稻爭光、爭水、爭肥，嚴重威脅水稻生產，造成水稻減產［2］。草甘膦是一種高效、廣譜除草劑，由于其作用的靶標酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）只存在于植物和微生物中，具有很高的毒理學和環境安全性。由于草甘膦除草劑集中了高效、安全、低成本、無殘留、易降解等諸多優點，從1996年以來，草甘膦／抗草甘膦轉基因農作物的雜草控制模式取得了巨大成功，世界范圍內約90%的轉基因（genetically modified，GM）農作物攜帶草甘膦抗性基因［3］。抗草甘膦除草劑GM水稻新品種的培育對于雜草控制和提高水稻產量有重要現實意義。2mG2-epsps是我國科學家林敏從熒光假單胞菌（pseudom onas fluorescens）G2菌株中克隆后經優化改造獲得的耐草甘膦新基因，具有自主知識產權［4］，本課題組前期培育成功的轉2mG2-epsps基因GM水稻新品系應用前景廣闊。

國際社會對GM作物及食品的安全性存在廣泛爭議，公眾對GM作物非預期變異效應影響人類健康的擔憂是GM作物商品化應用的主要障礙［5］。非預期效應是指除了由目的基因插入產生的可預料效應之外，在相同環境和條件下種植的GM作物與非轉基因親本在表型、反應和成分上所表現的統計學顯著差異［6］。人們擔心GM作物的非預期效應可能影響食品的營養價值，甚至可能產生對人類和動物健康有害的毒素［5］。1993年OECD（Organization for Economic Cooperation and Development）提出的實質等同性原則是GM食品安全性評價的重要依據，旨在通過比對分析識別GM作物與親本之間相似的和不等同的新成分，然后對新成分進行進一步的毒理學評價［7］。在成分比對方面，由于DNA和RNA通常不具有食品安全風險，GM作物安全性評價主要以基因表達產物特別是蛋白質作為分析對象［8］。根據溶解性，稻米蛋白可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白［9］。本研究根據實質等同性原則，分析抗草甘膦GM水稻種子可溶性蛋白含量和組分的非預期變異，為抗草甘膦GM水稻的安全性評價和商品化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉2mG2-epsps基因純合株系T12、T22和各自的非轉基因親本對照粳稻品種日本晴（P1）、JP574（P2），于2013年12月種植于海南轉基因試驗田，2014年5月收獲水稻種子，自然曬干后4℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 稻米可溶性蛋白提取

水稻種子經脫殼、磨粉、過80目篩，用丙酮脫脂制成脫脂米粉。按參考文獻［9］方法，分別用蒸餾水、5%NaCl、70%乙醇和0.1 mol／L NaOH依次從脫脂米粉中分級提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。采用Bradford方法［10］測定蛋白質濃度，換算出每g脫脂米粉中各種可溶性蛋白的含量。

蛋白含量（mg／g脫脂米粉）＝蛋白濃度（mg／mL）×提取液體積（mL）／脫脂米粉質量（g）

1.2.2 稻米蛋白組分SDS-PAGE分析

參照江紹玫等［11］的SDS-PAGE電泳法分析稻米4種蛋白組分。采用Tris-甘氨酸高pH不連續緩沖系統，14%分離膠，5%濃縮膠，每孔上樣蛋白質量為8 μg。采用恒壓式電泳，濃縮膠電壓為80 V，樣品進入分離膠后調至130 V。電泳結束后經考馬斯亮藍R-250染色，脫色后，用Bio-Rad凝膠成像系統拍照，用Quantity one軟件對電泳圖譜中的蛋白質組分條帶進行定量取值分析。

1.2.3 數據處理與統計分析

水稻種子可溶性蛋白含量測定時，每個樣品設3次重復，結果以X±s（平均數±標準誤）表示，并以P為對照，應用Origin軟件對GM水稻樣本數據進行差異顯著性統計分析。

用Quantity one軟件對SDS-PAGE電泳條帶進行掃描定量分析取值時，將親本具有的蛋白組分條帶含量取值定義為1，當GM水稻樣本某蛋白組分含量的取值比親本相應的條帶增加或減少0.40倍和0.80倍以上時，標記為該蛋白組分與親本差異顯著和極顯著，視為非預期變異組分。

分別以P1和P2為對照，對T12和T22 2個GM水稻株系的種子可溶性蛋白含量進行差異顯著性分析（表1），并將T12和T22的可溶性蛋白含量變異趨勢和幅度匯總于表2。T12和T22的總可溶性蛋白含量分別比各自親本降低3.43%和6.43%，差異顯著。T12的球蛋白含量比P1顯著增加，谷蛋白卻比P1極顯著降低。T22株系除了清蛋白含量比親本顯著增加外，球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量均比P2

顯著或極顯著降低，變異幅度在3.86%～9.12%之間。由于谷蛋白占比最多，因此，GM水稻種子總可溶性蛋白含量降低的變異幅度主要由谷蛋白含量決定。

表1 轉基因水稻與親本種子可溶性蛋白含量（mg／g米粉）變異分析

表2 轉基因水稻種子可溶性蛋白含量變異趨勢和幅度匯總

2 結果與分析

2.1 GM水稻的種子蛋白含量變異分析

T12和T22這2個GM水稻株系與各自親本的種子可溶性蛋白質含量的比較結果見表1。2個親本品種P1和P2的可溶性蛋白質含量差異顯著，P2品種的總可溶性蛋白顯著高于P1。4種可溶性蛋白中，谷蛋白占比最大，分別達到P1和P2總可溶性蛋白的67.67%和65.27%，但在2個親本品種間谷含量差異不顯著。P2的清、球、醇溶蛋白含量分別比P1增加6.27%、14.67%、9.95%，說明水稻種子可溶性蛋白質含量存在天然的品種差異。

2.2 GM水稻種子蛋白組分變異的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析時，由于考馬斯亮藍R250染料與蛋白質的定量結合效應，電泳后單個樣本對應的泳道中分離的蛋白條帶染色的濃淡可反映組分在總蛋白含量中的相對占比。對于不同樣本而言，只有當上樣的蛋白質量相等時，才能根據條帶顯色的濃淡比較分子量相同的蛋白組分在不同樣本間的含量差異。將GM水稻株系T12、T22及其各自親本種子的4種可溶性蛋白（清、球、醇、谷）提取液定量測定后，根據蛋白濃度調整電泳上樣量均為8 μg，進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖1。由于電泳分析時各樣本上樣量一致，所以電泳條帶的濃淡可以反映相應蛋白組分的相對含量多少，根據掃描定量取值結果，將2個轉基因樣本T12和T22相對親本的種子蛋白變異組分信息匯總至表3，同時列出分子量為14～16 ku的水稻過敏原蛋白條帶的定量取值分析結果。

2.2.1 非轉基因親本P1和P2的種子蛋白組分比較

水稻種子清蛋白（圖1a）條帶最多，蛋白組分復雜，從正極到負極分子質量分布范圍在9～100 ku之間。P1和P2的清蛋白電泳圖譜相似，組分的含量差值均低于0.4倍，差異不顯著。球蛋白組分的電泳條帶在圖譜中分布清晰（圖1b），共12個條帶，P1與P2組分一致，只是P2的24 ku和56 ku球蛋白組分含量比P1分別增加0.80倍和0.75倍，差異顯著。醇溶蛋白組分集中于14～16 ku區域（圖1c），P1的醇溶蛋白組分的電泳條帶14 ku和16 ku比P2的稍淡；兩親本谷蛋白組分的電泳圖譜相似，都包括9、14、19～23、33～38、41和56 ku（圖1d）。在本研究定義的差異水平條件下，P1和P2的清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白組分差異不顯著，僅球蛋白的個別組分在含量上有所不同。

圖1 轉基因水稻株系與非轉基因親本種子蛋白組分的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2.2 GM水稻種子蛋白組分變異分析

GM水稻株系T12、T22與各自親本的清蛋白的電泳圖譜比較分析結果（圖1a和表3）表明，T12的89 ku清蛋白含量比P1增加0.42倍，T22株系的89 ku清蛋白含量卻比P2減少0.43倍，差異顯著。從圖1b和表3結果可知，GM水稻種子球蛋白組分變異較多。與親本P1相比，T12株系的65、56、24 ku含量顯著增加，變異幅度在0.61～0.65倍之間。T22株系65、57、56、24、21 ku含量顯著降低，僅相當于P2相應組分含量的1%～55%。

T12和T22株系的14～16 ku醇溶蛋白組分與相應親本相比，含量有變化，但差異不顯著（圖1c和表3）。谷蛋白電泳圖中（圖1d），T12和T22與各自的親本相比，變異趨勢一致，突出的非預期變異是均新增加了56 ku和41 ku條帶。并且33～38 ku、19～23 ku條帶含量顯著增加，100 ku和9 ku條帶含量比親本顯著減少，取值變異幅度在0.48～0.82倍之間（表3）。

總體上，GM水稻種子的清、球、醇、谷4種蛋白均存在顯著變異的蛋白組分，除了新增的41 ku和56 ku谷蛋白外，其他蛋白組分的非預期變異主要表現為含量上的增加或降低。

表3 轉基因水稻與非轉基因親本相比種子蛋白組分變異情況匯總

2.2.3 GM水稻種子14～16 ku蛋白組分的變異分析

對于GM水稻蛋白組分的安全性評價中，作為稻米主要抗營養因子的過敏原蛋白非常值得關注。其中14～16 ku蛋白包含水稻常見的主要過敏原。圖1顯示，水稻種子清、球、醇溶蛋白電泳圖譜中均包含14～16 ku蛋白區帶，谷蛋白只有14 ku蛋白條帶。定量取值結果（表3）表明，雖然4種可溶性蛋白中，GM水稻14～16 ku蛋白與親本相比未達到本試驗定義的差異顯著水平（比親本增加或降低0.4倍及以上），但含量出現變化。其中T12株系的14～16 ku醇溶蛋白含量比P1增加了21%，14 ku谷蛋白組分含量則比P1降低了25%。T22株系的14～16 ku清蛋白含量比P2增加了32%，14～16 ku醇溶蛋白和谷蛋白組分含量分別比親本降低了30%和21%。

3 討論

培育抗草甘膦轉基因水稻對稻田雜草控制意義重大［12］。實質等同性評價是轉基因水稻商品化應用的必要前提。結果表明，2個抗草甘膦GM水稻株系T12和T22的種子可溶性蛋白含量和組分均存在非預期變異。這與前人對轉基因水稻蛋白質變異的研究結果類似［13-14］。

稻米蛋白在水稻不同亞型、品種間存在明顯差異［15］。本試驗GM水稻種子的清、球、醇、谷4種可溶性蛋白含量的最高變異幅度（9.12%）低于P1和P2兩親本之間的最大差異幅度（14.67%）。2004年，OECD發布的水稻新品種關鍵營養成分含量的共識性文件顯示，糙米蛋白含量為7.1%～8.3%［16］，GM水稻株系T12和T22的總可溶性含量分別為71.77和71.32 mg／g，屬于水稻的正常變異范圍。然而，稻米蛋白組分對營養品質影響較大，比如清蛋白和球蛋白含多種生理活性蛋白［17］，其中稻米α-球蛋白能顯著降低小鼠血清中的膽固醇［18］，14～16 ku蛋白中的淀粉酶抑制劑具有降血糖的生理功能，也可能引發食物過敏反應［19-20］。因此，GM水稻種子的營養品質可能與親本品系存在差異。

在蛋白組分方面，GM水稻T12和T22株系分別有12和14個蛋白譜帶發生了非預期變異，涉及清、球、醇、谷4種可溶性蛋白組分，多數表現為含量的增減。以谷蛋白組分為例說明蛋白電泳條帶反映的組分變異與總蛋白含量之間的關系。與親本相比，2個GM水稻株系的33～38 ku、19～24 ku谷蛋白條帶含量顯著增加，甚至產生了56 ku、41 ku新組分，但不能由此預測GM水稻總谷蛋白含量的變異方向是增加。這是因為谷蛋白組分的SDS-PAGE分析是以各對比樣本電泳上樣總蛋白量相等為前提的，條帶濃度增加只能說明其相對含量占比在GM水稻總谷蛋白中提高。同理，GM水稻100 ku和9 ku谷蛋白條帶的相對含量占比比親本顯著減少（圖1d和表3）。事實上，GM水稻株系T12和T22的總谷蛋白含量均比親本極顯著降低（表1），由于谷蛋白含量占比高達稻米總蛋白的75%～90%［16］，GM水稻種子總可溶性蛋白含量顯著降低的變異可能主要受谷蛋白含量變異影響。從安全的角度，2個GM水稻株系新增加的41 ku和56 ku谷蛋白組分，需要進一步的食品毒理學評價。

過敏原是GM水稻安全性評價的關鍵因素。雖然2個GM水稻株系14～16 ku蛋白組分含量與親本相比未達到本試驗定義的差異顯著水平（表3），但含量變化仍值得關注，因為14～16ku清蛋白和球蛋白包含水稻主要的過敏原蛋白［16，20］，其相對含量占比可能影響GM稻米的過敏原性。其中T22株系的14～16 ku清蛋白含量比P2增加了32%，T12株系的14～16 ku清蛋白和球蛋白含量與P1表現為實質等同。可見，對GM水稻株系的過敏原安全性評價應遵從個案分析原則。

需要指出的是，以非轉基因親本為對照樣本的實質等同性比對結果，不能揭示GM水稻非預期變異的技術來源，無法判定這些非預期變異由轉基因插入引起。這是因為，GM水稻的培育包括多個技術環節，特別是GM水稻經歷的組織培養也可能導致非預期變異效應［21］，由組織培養導致的無性系變異（somaclonal variation）應用于小麥、玉米、水稻、高粱等的品種改良已有數十年的歷史［22］，目前不需要進行安全性評估就能應用于生產實踐。Zhou等［23］報道組織培養對水稻的代謝物輪廓譜的改變比轉基因插入的影響更顯著。Herman等［24］在綜述20年來GM作物與非轉基因對照之間的實質等同性分析結果的基礎上，指出懷疑轉基因技術比傳統育種手段可能引發更嚴重的非預期變異缺乏事實依據。建議在實質等同性分析時，增加GM水稻培養過程中獲得的組織培養再生株系作為對照樣本，區分GM水稻的非預期變異來源于轉基因插入突變還是組織培養無性系變異，能為GM水稻的安全性評價提供更充分的實驗依據。

4 結論

抗草甘膦GM水稻株系T12和T22的種子可溶性蛋白含量和組分均存在非預期變異，但清、球、醇、谷4種可溶性蛋白含量的變異幅度在安全范圍內，組分變異多數為含量的增減。GM水稻種子的營養品質可能與親本存在差異。GM水稻株系新增加的41 ku和56ku谷蛋白組分需要進一步的食品安全性評價。

［1］朱德峰，程式華，張玉屏，等.全球水稻生產現狀與制約因素分析［J］.中國農業科學，2010，43（3）：474-479 Zhu D F，Cheng S H，Zhang Y H，et al.Analysis of status and constraints of rice production in the world［J］.Journal of Integrative Agriculture，2010，43（3）：474-479

［2］梁帝允，強勝.我國雜草稻危害現狀及其防控對策［J］.中國植保導刊，2011，31（3）：21-24 Lang D Y，Qiang S.Present situation of Oryza sativa and Prevention control measures in China［J］.China Plant Protection，2011，31（3）：21-24

［3］Duke S O，Powles S B.Glyphosate：a once-in-a-century herbicide［J］.Pest Management Science，2008，64（4）：319-325

［4］孫鶴，郎志宏，陸偉，等.轉2mG2-epsps基因煙草的草甘膦耐受性分析［J］.中國農業科技導報，2009，11（4）：100-106 Sun H，Lang Z H，Lu W，et al.Analysis of Glyphosate Tolerance in Transgenic Tobacco with 2mG2-epsps Gene［J］. Journal of Agricultural Science and Technology，2009，11（4）：100-106

［5］Zhao X，Tang T，Liu F，et al.Unintended changes in genetically modified rice expressing the lysine-rich fusion protein gene revealed by a proteomics approach［J］.Journal of Integrative Agriculture，2013，12（11）：2013-2021

［6］趙艷，李燕燕.組學技術評價轉基因農作物的非預期效應［J］.遺傳，2013，35（12）：1360-1367 Zhao Y，Li Y Y.Unintended effects assessment of genetically modified crops using omics techniques［J］.Hereditas，2013，35（12）：1360-1367

［7］Kuiper H A，Kleter G A，Noteborn H P J M，et al.Assessment of the food safety issues related to genetically modified foods［J］.the Plant Journal，2001，27（6）：503-528

［8］Parrott W，Chassy B，Ligon J，et al.Application of food and feed safety assessment principles to evaluate transgenic approaches to gene modulation in crops［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48（7）：1773-1790

［9］Ju Z Y，Hettiarachchy N S，Rath N.Extraction，denaturation and hydrophobic properties of rice flour proteins［J］. Journal of Food Science，2001，66（2）：229-232

［10］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analysis Biochemistry，1976，72（1）：248-254

［11］江紹玫，朱速松，劉世家，等.水稻谷蛋白突變體的篩選及遺傳分析［J］.遺傳學報，2003，30（7）：641-645 Jiang S M，Zhu S S，Liu S J，et al.Screening and genetic analysis of rice glutelin mutant［J］.Acta Genetica sinica，2003，30（7）：641-645

［12］朱玉，于中連，林敏.草甘膦生物抗性和生物降解及其轉基因研究［J］.分子植物育種，2003，1（4）：435-442 Zhu Y，Yu Z L，Lin M.Bioresistance or biodegradation of glyphosate and construction of transgenic plants［J］.Molecular Plant Breeding，2003，1（4）：435-442

［13］Wang Y，Xu W，Zhao W，et al.Comparative analysis of the proteomic and nutritional composition of transgenic rice seeds with Cry1ab／ac genes and their non-transgenic counterparts［J］.Cereal Science，2012，55（2）：226-233

［14］Xue K，Yang J，Liu B，et al.The integrated risk assess-ment of transgenic rice Oryza sativa：a comparative proteomics approach［J］.Food Chemistry，2012，135（1）：314-318

［15］吳偉，程方民，劉正輝.我國江浙地區粳稻品種間的植酸與蛋白質組分差異及其相關性［J］.中國水稻科學，2007，21（3）：331-334 Wu W，Cheng F M，Liu Z H.Variations in grain phytic acid and protein contents among japonica rice cultivars from jiangsu-zhejiang area and their correlation［J］.Chinese Journal of Rice Science，2007，21（3）：331-334

［16］OECD.Consensus document on compositional considerations for new varieties of rice（Oryza sativa）：key food and feed nutrients and antinutrients［A］.Series on the Safety of Novel Food and Feed，2004

［17］Ellepola S W，Choi S M，Phillips D L，et al.Raman spectroscopic study of rice globulin［J］.Journal of Cereal Science，2006，43（1）：85-93

［18］Tong L，Fujimoto Y，Shimizu N，et al.Rice α-globulin decreases serum cholesterol concentrations in rats fed a hypercholesterolemic diet and ameliorates atherosclerotic lesions in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Food Chemistry，2012，132（1）：194-200

［19］魏鵬娟，王魯峰，徐曉云，等.α-淀粉酶蛋白類抑制劑的研究進展［J］.食品科學，2011，32（9）：312-318 Wei P J，Wang L F，Xu X Y，et al.Research Progresses on Proteinaceous α-Amylase Inhibitors［J］.Food Science，2011，32（9）：312-318

［20］Nakase M，Adachi T，Urisu A，et al.Rice（Oryza sativa L.）α-amylase inhibitors of 14-16 kDa are potential allergens and products of a multigene family［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44（9）：2624-2628

［21］Phillips R L，Kaeppler S M，Olhoft P.Genetic instability of plant tissue cultures：breakdown of normal controls［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，1994，91（12）：5222-5226

［22］袁云香，張瑩.水稻組織培養的研究進展［J］.江蘇農業科學，2010（1）：83-86 Yuan Y X，Zhang Y.Advances on f rice tissue culture［J］. Jiangsu Agricultural Sciences，2010（1）：83-86

［23］Zhou J，Zhang L，Li X，et al.Metabolic profiling of transgenic rice progeny using gas chromatography-mass spectrometry：the effects of gene insertion，tissue culture and breeding［J］.Metabolomics，2012，8（4）：529-539

［24］Herman R A，Price W D.Unintended compositional changes in genetically modified（GM）crops：20 years of research［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61：11695-11701.

Analysis of Protein Unintended Variation of Transgenic Rice Seeds with 2mG2-epsps Gene

Li Yanyan Zhao Yan

（College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018）

The unintended variation of soluble protein contents and components of genetically modified（GM）rice seeds were analyzed，using glyphosate-resistant GM rice lines harboring 2mG2-epsps gene as materials，according to the principle of substantial equivalence.The results showed that the total soluble protein contents of GM rice seeds decreased very significantly，which were mainly affected by the glutenin content variation，compared to the non-transgenic parent lines.While the maximum content variation range（9.12%）from four kinds of proteins including albumin，globulin，prolamin，glutenin，was lower than the variation difference（14.67%）between the two parent varieties，P1 and P2.This indicated that the unintended variation of soluble protein contents of GM rice lines was within the safety range，but the nutritional quality of GM rice seeds might be different from their parent varieties. SDS-PAGE analysis reveals that there were 12 and 14 unintended variation protein bands in the respective GM rice line T12 and T22，concerning components of four kinds of soluble proteins and most exhibit content changes.Notably，two new glutenin bands of 41 ku and 56 ku were produced in all the two GM rice lines，which must be subjected to further toxicology test for food safety evaluation.

genetically modified rice，seed soluble proteins，substantial equivalence，unintended variation

S188

A

1003-0174（2017）01-0001-06

國家自然科學基金（30871511），農業部轉基因生物新品種培育重大專項（2011ZX 08010-003）

2015-04-23

李燕燕，女，1987年出生，碩士，生物工程

趙艷，女，1970年出生，教授，植物生化與分子生物學