無溶劑體系酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯及其性質研究

包雪梅 牛黎莉 汪 月 陳 瑾 禹 潔 方琳凱 張 珍 張盛貴

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070）

無溶劑體系酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯及其性質研究

包雪梅 牛黎莉 汪 月 陳 瑾 禹 潔 方琳凱 張 珍 張盛貴

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，蘭州 730070）

在無溶劑體系中，采用Novozyme 435作為催化劑，肉豆蔻酸和馬鈴薯淀粉作為原料，制備不同取代度的肉豆蔻酸淀粉酯。研究反應溫度、脂肪酶添加量、底物比（淀粉∶肉豆蔻酸）及反應時間對淀粉酯取代度的影響，并對原淀粉及不同取代度的酯化淀粉的物化性質進行了研究。結果表明，反應溫度60℃，脂肪酶添加量2%，底物比1∶4，反應時間25 h時，制得的肉豆蔻酸淀粉酯的取代度為0.056。肉豆蔻酸淀粉酯具有較好的疏水性及乳狀液穩定性，凝膠強度較原淀粉有所下降。

酶促合成 馬鈴薯淀粉 肉豆蔻酸淀粉酯

肉豆蔻酸即十四烷酸，屬于中長鏈脂肪酸，在淀粉中引入類似的疏水性有機碳鏈，可改善原淀粉的冷水不溶性、糊熱穩定性差、抗剪切性能低等缺點，制得具有特殊的熱塑性、疏水性、乳化性和可生物降解性的脂肪酸淀粉酯［1-2］，并使淀粉具備了親水親油的雙親性質［3-4］。目前，國內外報道的制備酯化淀粉的方法有水媒法、溶劑法、熔融法等，而以脂肪酶為催化劑的合成方法則為少見［5］；酶法制備的脂肪酸淀粉酯具有天然綠色、低碳環保等優點［6］，更適合應用于食品和醫藥行業［6］。Novozyme 435是一種固定化脂肪酶，其底物作用范圍寬且性質穩定，可廣泛應用于水解、酯化、轉酯化反應。Lin等［1］報道以Novozyme 435作為催化劑，酶促合成的松香酸淀粉酯，其熱穩定性、溶解度、膨脹度及透明度相對于原淀粉均有所改善。與傳統的水相和有機相酶催化相比，無溶劑體系酶催化的研究較大地擴展了酶的應用范圍。無溶劑體系中，酶直接作用于底物，提高了底物、產物濃度以及反應選擇性［7］，純化過程容易、步驟少，因不用或少用有機溶劑而大大降低了對環境的污染，降低了回收有機溶劑的成本［8］。王艷等［9］報道了在無溶劑體系中，以玉米淀粉和油酸為原料，制得取代度為0.201的油酸淀粉酯。但使用無溶劑體系，酯化反應速率較低，有助于生產滿足食品需要的低取代度淀粉酯。

國內外關于酯化淀粉的研究已經有很多文獻報道［10-11］，但是對酶促合成肉豆蔻酸酯化淀粉的研究鮮見報道。本試驗采用無溶劑體系酶促合成法，以預處理淀粉為原料，肉豆蔻酸為酯化劑，Novozyme 435作催化劑，研究了不同反應條件對豆蔻酸淀粉酯取代度的影響，并對不同取代度酯化淀粉進行FTIR、疏水性、質構特性及微觀結構等性質進行測定。以期為酶促合成中長鏈脂肪酸淀粉酯制備方面的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯淀粉：甘肅薯界淀粉有限公司；Novozym 435（活力：10 000 PLU／g）：諾維信（中國）投資有限公司；肉豆蔻酸：天津市光復精細化工研究所；其他試劑或藥品均為分析純；3A型分子篩：上海山浦化工有限公司；溴化鉀：德州潤昕實驗儀器有限公司。

FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀：中國天津港東科技發展股份有限公司；UV-2450型紫外分光光度計：日本島津有限公司；TA.XT型質構儀：Texture Analyser Stable Micro Systems公司；FS-400D高速分散器：北京同德創業科技有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡：奧林巴斯（廣州）工業有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 肉豆蔻酸淀粉酯的合成方法

稱取一定質量的肉豆蔻酸、Novozym 435、馬鈴薯淀粉分別置于裝有3A分子篩的3個標記好的密閉容器中靜置48 h，以平衡體系水分。肉豆蔻酸置于150 mL碘量瓶中，60℃水浴融化后，加入一定質量比的馬鈴薯原淀粉和Novozym 435，在一定溫度條件下以180 r／min的轉速磁力攪拌，反應期間加入一定量的3A分子篩，一定時間后加入10 mL 60℃95%乙醇浸泡10 min以沉淀肉豆蔻酸淀粉酯，然后抽濾，后用60℃熱無水乙醇洗滌數次，恒溫干燥至恒重，粉碎及過篩（80目）、密封貯藏。

1.2.2 取代度的測定

參考王艷［4］的測定方法，并略作改進。稱取1.50 g烘干樣品于250 mL碘量瓶中，加入25 mL蒸餾水，5 mL無水乙醇，25 mL 0.25 mol／L NaOH溶液，常溫振蕩60 min。取出，滴加酚酞指示劑，用0.1 mol／L

HCl溶液滴定，滴至粉紅色剛好消失，記錄耗用鹽酸的體積數V1。同時進行空白試驗，記錄耗用鹽酸的體積數V0。肉豆蔻酸淀粉酯取代度按式（1）計算。

式中：DS為取代度；V0為滴定空白所需要的HCl量／mL；V1為滴定樣品所需要的HCl量／mL；c為標準鹽酸的摩爾濃度／mol／L；m為樣品的質量／g；211為肉豆蔻酸酰基的分子量；162為脫水葡萄糖單元的分子量。

1.2.3 不同反應條件對酯化反應的影響

方法1.2.1中，研究反應溫度為55、60、65、70、75℃；淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6；脂肪酶用量為脂肪酶添加量為淀粉（絕干）質量的0%、0.5%、1%、2%、4%；反應時間5、10、15、20、25、30 h等不同反應條件對酯化反應的影響。反應完成后用方法1.2.2測定淀粉酯的取代度。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析（FTIR）

參照Colussi等［12］的方法測定。

1.2.5 淀粉質構特性

參照Einhorn等［13］、Reddy等［14］的方法，并略作改進。稱取6.0 g淀粉，置于150 mL燒杯中配置質量分數為6%的淀粉乳，在沸水浴中攪拌30 min，至淀粉完全糊化，后于4℃冰箱中放置24 h。用TA. XT型質構儀測定其質構特性（硬度、彈性、膠黏性、回復力、內聚性及咀嚼性）。試驗參數設定：選用TPA壓縮模式，探頭型號P／5，測試前下降速率1.0 mm／s，測試速率1.0 mm／s，測試后上升速率1.0 mm／s，停留間隔5 s，2次壓縮間隔5 s，壓縮程度30%，感應力3 g，數據提取速率200 pps。每個樣品重復6次。

1.2.6 疏水性測定

參考Tupa等［15］的方法測定。

1.2.7 乳狀液的制備

參考朱波等［16］的制備方法，并略作改進，稱取（0.5±0.05）g樣品（以干基計）分散于25 mL蒸餾水中，于沸水浴中充分加熱糊化15 min，冷卻至室溫后，于樣品糊中加入25 mL大豆色拉油，用FS-400D型高速分散器以13 500 r／min的轉速分散2 min，得到的乳狀液加入NaN3（0.02%，m／V）作為抑菌劑。

1.2.8 微觀結構

參考朱波等［16］的方法，觀察乳狀液的微觀結構。

1.2.9 數據分析

每組試驗均重復3次，采用Origin 8.0及SPSS 17.0等軟件對數據進行統計分析。數據用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 不同反應條件對酯化反應的影響

反應溫度、底物比、反應時間及脂肪酶添加量對酯化反應的影響如圖1所示。

圖1 不同反應條件對酯化反應的影響

由反應溫度對酯化反應的影響可知，當選取淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）為1∶5、脂肪酶添加量為2%、反應時間為20 h，反應溫度在55～75℃范圍時，酯化產物的取代度呈現先增大后減小的趨勢，在60℃時取代度達到最大0.042±0.001，之后顯著下降（P＜0.05），在75℃時，取代度達到0.015±0.002，顯著低于60℃時酯化淀粉的取代度（圖1）。可見，適當的高溫有助于提高淀粉溶脹能力及肉豆蔻酸的擴散速度［15］，但當溫度超過60℃后，產物取代度迅速下降，主要原因是溫度過高，部分脂肪酶失活（Novozyme 435脂肪酶最適溫度范圍為40～60℃），導致酯化效率降低，取代度降低。所以本試驗選擇的反應溫度為60℃。

由底物比對酯化反應的影響可知，當脂肪酶添加量為2%、反應時間為20 h、反應溫度為60℃時，隨著淀粉：肉豆蔻酸比值的降低，產物的取代度呈現先增大后降低的趨勢，當比值為1∶4時，酯化淀粉取代度達到最大0.048±0.002（圖1）。Bayazeed等［17］研究發現，高乙酸酐濃度導致較高的分子碰撞率，與淀粉分子更大程度的發生反應。當底物濃度過低時，脂肪酶未完全被底物飽和，使產物取代度較低。但當底物濃度過高時，脂肪酶達到飽和，限制了酯化反應，取代度降低。選擇適當的底物比，一方面可以提供所需要的酰基供體，另一方面可以降低反應體系的粘度，有利于產物的生成，因此本試驗選擇的最適底物比為1∶4。

由反應時間對酯化反應的影響可知，當淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）為1∶4、脂肪酶添加量為2%、反應溫度為60℃時，反應時間在5～30 h范圍內，隨著反應時間的增加，酯化產物的取代度呈現先增大后降低的趨勢，當反應時間達到25 h時，取代度達到最大0.056±0.001（圖1）。主要由于反應時間增加，各底物接觸較充分，酯化反應程度增加，取代度提高。但是，反應時間過長，取代度下降，一方面由于剪切作用影響酶的穩定性，導致酶催化效率降低，另一方面，反應開始逆方向進行，副產物濃度增加，酯化產物濃度降低［4］，產物取代度顯著下降。由此，25 h為最佳反應時間。

由脂肪酶添加量對酯化反應的影響可知，當淀粉∶肉豆蔻酸（m／m）為1∶4、反應時間25 h、反應溫度60℃，酶添加量在0%～4%范圍內時，肉豆蔻酸淀粉酯的取代度隨著脂肪酶添加量的增加呈現先增大后降低的趨勢，當脂肪酶添加量為2%時，其取代度達到最大為0.056±0.003（圖1）。酶濃度的提高僅僅縮短了到達反應平衡的時間，當酶濃度升高到一定程度時，再增加其濃度，取代度不僅不再明顯上升，反而有所下降。主要原因是脂肪酶發生團聚影響底物與酶活性中心的接觸［4］。并且由于酶添加量的增多，反應體系黏稠度增加，不利于產物的形成。綜上，本試驗脂肪酶添加量應選擇2%。

2.2 傅里葉紅外光譜分析（FTIR）

對比圖2中不同樣品的紅外光譜圖可發現，馬鈴薯原淀粉及不同DS的肉豆蔻酸淀粉酯在3 438.46 cm-1附近都出現了強而寬的—OH伸縮振動和羥基氫鍵締合后的特征吸收峰。但是，不同DS淀粉酯光譜圖中—OH的吸收峰明顯低于馬鈴薯原淀粉，并且隨著DS的增加該特征吸收峰越來越平緩。這是由于淀粉中的一部分羥基被酯化形成羰基，使—OH總體數量減少，可證明淀粉成功接枝了脂肪酸形成酯。1 743 cm-1處的吸收峰是酯羰基＝CO的伸縮振動吸收峰，是酯的特征吸收峰［18］，對比圖5中的6條紅外光譜曲線，可發現在此波數處出現酯羰基的特征吸收峰，并且隨著DS的增大，該吸收峰略有升高，但由于DS都比較低，吸收峰不是很明顯。

圖2 馬鈴薯原淀粉與肉豆蔻酸淀粉酯（DS：0.025～0.056）的紅外光譜圖

2.3 淀粉質構特性

從表1可以看出，馬鈴薯原淀粉與不同取代度的酯化淀粉的內聚性、回復性無明顯變化。與原淀粉相比，酯化淀粉的硬度、膠黏性、咀嚼性變小，而彈性有所增大。這主要是由于由于長鏈脂肪酸疏水性有機碳鏈的引入，導致分子間氫鍵的斷裂，淀粉的晶體結構被破壞，分子結構松散，分子的纏結點減少，致使淀粉的凝膠強度變弱［19］。

表1 淀粉質構特性參數

2.4 疏水性測試

對肉豆蔻酸淀粉酯的疏水性進行定性測試，將樣品置于含有等體積蒸餾水和石油醚的兩相試管中。馬鈴薯原淀粉立即下沉至水相中，呈現不透明狀（圖3a）。相反，肉豆蔻酸淀粉酯沒有立即下沉至水相，反而漂浮在非極性與極性相間（圖3b～圖3f）。說明乙酰化淀粉優先留在上層有機相的最底層。盡管該方法較簡單，但仍然可證明酯化淀粉表面極性的改變。

圖3 疏水性結果

2.5 乳狀液微觀結構分析

圖4 乳狀液在37℃烘箱內儲藏第1天的微觀結構圖

圖5 乳狀液在37℃烘箱內儲藏第12天的微觀結構圖

為了反映不同DS的肉豆蔻酸淀粉酯的乳狀液穩定性的區別，對6組乳狀液進行儲藏試驗，在第1天和第12天采用數碼顯微鏡對乳狀液的微觀結構進行觀察。從圖4～圖5中可以看出，在第1天時，相對原淀粉形成的乳狀液體系（圖4a）而言，酯化淀粉（圖4b～圖4f）油滴平均粒徑較大，且分布均勻。貯藏12 d后，原淀粉形成的乳狀液已發生聚集和絮凝（圖5a），對酯化淀粉而言，乳狀液油滴平均粒徑增大，但未發生明顯的聚集和絮凝，且酯化淀粉取代度越大，乳狀液油滴平均粒徑增大越小，乳狀液體系穩定（圖5b～圖5f）。

3 結論

試驗研究了在無溶劑體系中，不同反應條件對肉豆蔻酸淀粉酯取代度的影響。改變反應條件，可制得取代度為0.025～0.056范圍內的肉豆蔻酸淀粉酯，且反應溫度為60℃、脂肪酶添加量為2%、底物比為1∶4、反應時間為25 h時制得的肉豆蔻酸淀粉酯的取代度為0.056。并應用FTIR、TA.XT型質構儀、數碼顯微鏡等，對原淀粉及不同取代度的酯化淀粉的物化性質進行研究。FTIR驗證了酯化淀粉的生成；疏水性定性測定驗證了疏水性基團的引入。研究表明，酯化淀粉的疏水性、乳狀液穩定性較原淀粉有很大改善，而其凝膠強度較原淀粉有所下降，更有利于工業生產。且無溶劑體系酶促合成肉豆蔻酸淀粉酯，為中長鏈脂肪酸淀粉酯制備的理論研究提供了依據。

［1］Lin R，Li H，Long H，et al.Structure and characteristics of lipase-catalyzed rosin acid starch［J］.Food Hydrocolloids，2015，43：352-359

［2］石佳，辛嘉英，王艷，等.酯化改性淀粉研究進展［J］.食品工業科技，2014，35（2）：395-399 Shi Jia，Xin Jiaying，Wang Yan，et al.Research progress of esterification modified starch［J］.Food Industry Science and Technology，2014，35（2）：395-399

［3］Eguchi S，Kitamoto N，Nishinari K，et al.Effects of esterified tapioca starch on the physical and thermal properties of Japanese white salted noodles prepared partly by residual heat［J］.Food Hydrocolloids，2014，35：198-208

［4］王艷.中長鏈脂肪酸淀粉酯的酶法合成及其性質研究［D］.哈爾濱：哈爾濱商業大學，2013 Wang Yan.Enzymatic synthesis and properties of medium long chain fatty acid starch ester［D］.Haerbin：Harbin University of Commerce，2013

［5］Aburto J，Alric I，Thiebaud S，et al.Synthesis，characterization，and biodegradability of fatty-acid esters of amylose and starch［J］.Journal of Applied Polymer Science，1999，74（6）：1440-1451

［6］Habulin M，?abeder S，Knez ?.Enzymatic synthesis of sugar fatty acid esters in organic solvent and in supercritical carbon dioxide and their antimicrobial activity［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2008，45（3）：338-345

［7］林凱，辛嘉英，王艷，等.非水相酶法催化長鏈脂肪酸淀粉酯反應研究進展［J］.食品科學，2014，35（3）：276-279 Lin Kai，Xin Jiaying，Wang Yan，et al.Research progress of non-aqueous enzymatic catalysis reaction of long chain starch fatty acid esters［J］.Food Science，2014，35（3）：276-279

［8］P?hnlein M，Hausmann R，Lang S，et al.Enzymatic synthesis and modification of surface-active glycolipids［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2015，117（2）：145-155

［9］王艷，辛嘉英，劉鐵，等.無溶劑體系酶催化油酸淀粉酯的合成［J］.中國糧油學報，2012，27（11）：39-44 Wang Yan，Xin Jiaying，Liu Tie，et al.Enzymatic synthesis in solvent-free system of oleic acid starch ester［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2012，27（11）：39-44

［10］李春勝，楊紅霞.酯化淀粉及其應用［J］.食品研究與開發，2006，26（6）：84-87 Li Chunsheng，Yang Hongxia.Esterified starch and the application［J］.Research and Development of Food，2006，26（6）：84-87

［11］Lim Y M，Hoobin P，Ying D Y，et al.Physical characterisation of high amylose maize starch and acylated high amylose maize starches［J］.Carbohydrate Polymers，2015，117：279-285

［12］Colussi R，Pinto V Z，El Halal S L M，et al.Structural，morphological，and physicochemical properties of acetylated high-，medium-，and low-amylose rice starches［J］.Carbohydrate Polymers，2014，103：405-413

［13］Einhorn-Stoll U，Weiss M，Kunzek H.Influence of the emulsion components and preparation method on the laboratory-scale preparation of o／w emulsions containing different types of dispersed phases and／or emulsifiers［J］.Food／Nahrung，2002，46（4）：294-301

［14］Reddy C K，Haripriya S，Mohamed A N，et al.Preparation and characterization of resistant starch III from elephant foot yam（Amorphophallus paeonifolius）starch［J］.FoodChemistry，2014，155：38-44

［15］Tupa M V，Ramírez J A á，Vázquez A，et al.Organocatalytic acetylation of starch：Effect of reaction conditions on DS and characterisation of esterified granules［J］.Food Chemistry，2015，170：295-302

［16］朱波，蔣將，李進偉，等.三種不同脂肪酸組成的油脂乳化液的理化性質研究［J］.食品工業科技，2013，34（14）：103-107 Zhu Bo，Jiang Jiang，Li Jinwei，et al.Study on the physicochemical properties of three kinds of different fatty acid composition of the oil emulsion［J］.Food Industry Science and Technology，2013，34（14）：103-107

［17］Bayazeed A，Farag S，Shaarawy S，et al.Chemical modification of starch via etherification with methyl methacrylate［J］.Starch-St?rke，1998，50（2-3）：89-93

［18］Biswas A，Shogren R L，Selling G，et al.Rapid and environmentally friendly preparation of starch esters［J］.Carbohydrate Polymers，2008，74（1）：137-141

［19］尹月斌，涂宗財，王輝，等.白櫟淀粉的特性［J］.食品科學，2013，34（1）：57-60 Yin Yuebin，Tu Zongcai，Wang Hui，et al.Characteristics of the white oak starch［J］.Food Science，2013，34（1）：57-60.

Solvent-Free System Enzymatic Synthesis of Myristate Acid Starch Ester and Properties

Bao Xuemei Niu Lili Wang Yue Chen Jin Yu Jie Fang Linkai Zhang Zhen Zhang Shenggui

（College of Food Science and Engineering，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070）Abstract In the solvent-free system，myristic acid and potato starch were used as raw materials，using Novozyme 435 as catalyst，to prepare starch myristate with different degrees of substitution.Effects of reaction temperature，the amount of lipase，starch／myristate acid weight ratio and reaction time on the degree of substitution of starch esters were studied.Then chemical and physical properties of native potato starch and esterified starch with different degrees of substitution were measured.The results showed the DS of the esterified starch was 0.056 when reaction temperature was 60℃，lipase dosage was 2%，substrate ratio was 1∶4，and reaction time was 25 h.Esterified starch had good hydrophobicity and emulsion stability，and the gel strength was declined compared with the native starch.

enzymatic synthesis，potato starch，starch myristate

S532

A

1003-0174（2017）01-0029-06

甘肅省農業生物技術研究與應用開發（GNSW-2014 -10），甘肅省農業科技創新（GNCX-2012-43）

2015-06-24

包雪梅，女，1991年出生，碩士，農產品加工及貯藏工程

張盛貴，男，1970年出生，教授，淀粉深加工