糖基化改性對大豆蛋白抗原性及結構特性的影響

布冠好 朱婷偉 陳復生

（河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001）

糖基化改性對大豆蛋白抗原性及結構特性的影響

布冠好 朱婷偉 陳復生

（河南工業大學糧油食品學院，鄭州 450001）

以大豆分離蛋白和葡聚糖為原料，在干熱條件下進行美拉德反應，制取不同時間下的糖基化復合物。以β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率為指標，采用間接競爭ELISA方法測定糖基化產物的抗原性，在反應6 d時，糖基化產物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分別降低了36.90%和18.12%。糖基化產物顏色加深，且游離氨基含量降低，說明大豆蛋白與糖發生了不同程度的反應。紅外光譜中糖鏈的引入，使蛋白質分子展開，β-轉角和無規則卷曲結構含量降低，影響了β-伴大豆球蛋白α亞基的抗原表位，從而可能使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反應影響抗原性的關鍵作用在于蛋白與糖結合部位對蛋白質結構變化的影響。

大豆分離蛋白 葡聚糖 糖基化 抗原性 結構

大豆作為一種優質的植物蛋白來源，被廣泛應用于食品以及飼料工業中。大豆中的蛋白質營養價值高且價格相對廉價，但大豆蛋白也是常見的8大食物蛋白過敏原之一。大豆分離蛋白（SPI）是一種蛋白質含量不低于90%的大豆產品，其主要成分包括大豆球蛋白與β-伴大豆球蛋白［1］。β-伴大豆球蛋白是7S的主要組成，是由3個亞基α（～67 ku）、α′（～71 ku）、β（～50 ku）組成的三聚體［2］。大豆球蛋白作為11S的主要組分，是一個六聚體蛋白質，每個亞基單位均含有一個酸性鏈和堿性鏈，并通過二硫鍵連接［3］。二者亦是大豆過敏原中兩種主要的過敏原，與大豆蛋白的結構特性有密切的關系［4］。在降低蛋白質過敏性試驗中，已有相關研究證實糖基化反應能有效降低蛋白質的抗原性。

本研究以大豆分離蛋白和葡聚糖為原料進行干法糖基化反應。分別以β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率為指標，采用間接競爭ELISA方法測定糖基化復合物抗原性的變化。通過顏色測定、游離氨基含量的測定、SDS-PAGE電泳以及傅里葉紅外光譜等方法測定糖基化反應程度和蛋白結構的變化。分析大豆蛋白糖基化產物的抗原性與結構之間的變化關系，為探究糖基化修飾對抗原性影響的作用機理、開發低敏性大豆蛋白制品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白（SPI，蛋白質質量分數92.46%）：山東谷神生物科技集團有限公司；葡聚糖：天津市科密歐化學試劑有限公司；β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin，C5868）、大豆球蛋白（glycinin，G3171）、酶標二抗（HRP標記的羊抗兔IgG，A6154）、2，4，6-三硝基苯磺酸（P2297-10 mL）：Sigma公司；兔抗βconglycinin血清、兔抗glycinin血清：實驗室自制；牛血清蛋白（BSA）、TMB單組份顯色液：北京索萊寶科技有限公司；低分子質量標準蛋白：中國科學院上海生物化學研究所。

TGJ-18型冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠；LRH-150F型恒溫生化培養箱：上海一恒科技有限公司；FC型酶標儀：賽默飛世爾儀器有限公司；電泳設備：北京六一實驗設備有限公司；CR-400彩色色差計：Konica Minolta公司；WQF-510型傅里葉紅外光譜：北京瑞麗分析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白-葡聚糖復合物的制備

將大豆分離蛋白和葡聚糖按質量比3∶1溶解于蒸餾水中，使最終溶液濃度為6%，混合均勻后進行真空冷凍干燥。取凍干的樣品置于鋁盒內，并將其放入干燥器內，以飽和KBr溶液來保持79%的相對濕度，然后將干燥器置于恒溫培養箱內，在60℃下制取不同反應時間的大豆分離蛋白-葡聚糖復合物。

1.2.2 糖基化產物抗原性測定

采用間接競爭ELISA方法來測定糖基化產物的抗原性，參考文獻［5］。分別用0.3 μg／mLβ-conglycinin和0.025 μg／mLglycinin標準抗原包被96孔酶標板，每孔100 μL，同時分別將1∶3 200稀釋度的抗β-conglycinin兔血清和抗glycinin兔血清與蛋白濃度為2 mg／mL的糖基化樣品液等體積加入離心管中，混勻；4℃冰箱過夜。次日甩去孔內液體，PBST（10 mmol／L，pH 7.40的磷酸鹽緩沖液PBS+0.05% Tween-20）洗滌4次，每次3 min，用吸水紙拍干；加100 μL／孔封閉液（PBS+1%BSA+0.1%Tween-20）進行封閉，37℃孵育1 h后，PBST洗滌4次，拍干；抗原抗體反應：將離心管中混合液加入酶標板孔內，每孔100 μL，在37℃孵育1 h后，PBST洗滌4次，拍干；加入1∶10 000稀釋度的酶標二抗，每孔100 μL，在37℃孵育1 h后，PBST洗滌4次，拍干；然后加入TMB單組份顯色液，每孔100 μL，37℃顯色10 min后，每孔加入50 μL 2 mol／L H2SO4終止反應。利用酶標儀雙波長測定各孔的OD值，實際OD值＝OD450-OD620。

抗原性的大小用抑制率來表示，抑制率表示樣品中抗原抑制兔抗血清與酶標板上包被的標準抗原結合能力的大小，可記為抗原抑制率；抑制率越低，則樣品的抗原性越低，二者呈正比關系；計算公式如下：

抗原抑制率＝（1-OD／OD0）×100%

式中：OD表示被測樣品的吸光值；OD0為無競爭體系的吸光值。

1.2.3 糖基化產物顏色測定

用CR-400彩色色差計來測定不同時間下糖基化產物的顏色，以L，a，b 3個指標來表示糖基化產物的色澤。其中L（0～100，黑～白）表示明度；a（-a～+a，綠～紅）和b（-b～+b，藍～黃）為色品指數。

1.2.4 游離氨基含量測定

采用三硝基苯磺酸（TNBS）法［6］對糖基化產物中游離氨基含量進行測定。用1%SDS溶解糖基化產物，使復合物中蛋白質的質量濃度為5 mg／mL。取0.25 mL的樣品液并加入2 mL磷酸緩沖溶液和2 mL 0.1%的TNBS溶液，混合均勻后在50℃下避光放置60 min，最后加入4 mL 0.1 mol／L的HCl終止反應。避光放置30 min后于420 nm下測其吸光值。

1.2.5 SDS-PAGE分析

糖基化產物用蒸餾水溶解，使最終蛋白質濃度為2 mg／mL，采用12%的分離膠，4%的濃縮膠進行不連續的凝膠電泳。其中上樣量為10 μL，電泳全過程采用恒流，開始電泳時調節電流至25 mA，當溴酚藍指示劑前沿進入到分離膠時將電流調至40 mA（約50 min）。電泳完成后（約2 h），將凝膠取出固定1 h，分別用考馬斯亮藍染色，最后脫色至蛋白質條帶清晰。

1.2.6 紅外光譜掃描

將糖基化樣品與干燥的溴化鉀以1∶100混合，用研缽均勻研成粉末，壓成薄片后，用傅里葉紅外分光光度計作全波段（4 000～400 cm-1）掃描，掃描32次。利用PeakFit V4.12軟件分析蛋白質的二級結構的變化。

1.2.7 數據分析

所有試驗測定重復3次，用SPSS 16.0軟件進行顯著性分析。利用Peak fit 4.20軟件計算蛋白質二級結構含量。

2 結果與討論

2.1 糖基化產物抗原性變化分析

抗原性的大小可用抗原抑制率來表示，不同時間下的大豆分離蛋白-葡聚糖復合物的抗原性變化如圖1所示。

圖1 不同時間下糖基化產物的抗原性變化

從圖1可以看出，隨糖基化反應時間的延長，糖基化產物的抗原性逐漸降低。反應6 d時，伴大豆球蛋白抗原抑制率和大豆球蛋白抗原抑制率分別為56.33%和77.42%；分別降低了36.90%和18.12%。說明糖基化處理能起到降低大豆蛋白抗原性的作用。引入糖鏈對抗原表位的掩蔽作用以及加熱過程中蛋白結構的變化，二者可影響糖基化產物的抗原性變化［7］。糖基化反應過程中，蛋白-糖或蛋白-蛋白之間的相互作用影響蛋白質的空間結構，對抗原表位進行掩蔽，從而降低了大豆蛋白的抗原性［8］。另一方面，伴大豆球蛋白本身是一種糖蛋白，而大豆球蛋白是一種不含糖基的六聚體蛋白質，且熱穩定性相對較高，當對大豆分離蛋白進行干熱糖基化處理后，伴大豆球蛋白組分受到影響大，因此，糖基化產物中的伴大豆球蛋白抗原抑制率降低效果比較明顯。有研究表明，美拉德反應所得到的產物中糖與蛋白結合形式穩定，遮掩抗原蛋白的抗原表位后經消化酶水解并沒有再次暴露，糖基化反應確為一種有效去除大豆抗原蛋白免疫原性的方法［9］。

2.2 顏色測定結果分析

美拉德反應在進行過程中會產生很多具有特征亮色的物質，色澤變化明顯，而且在一定的條件下，可以產生不同的特征顏色物質，如：橘黃色、黃色、藍色以及紅色產物等［10］。試驗中不同時間下樣品顏色的變化如表1所示。

表1 糖基化產物的色差分析結果

從表1可以看到，隨反應時間的增加，L值呈下降趨勢，a值和b值均隨反應時間的延長呈上升的趨勢。a值代表紅色，正值越大說明樣品顏色偏紅，b值增大，說明樣品顏色偏黃。整體上產物的顏色開始由紅黃色逐漸變為紅褐色。產物顏色的變化情況間接反映美拉德反應的進程。類黑精等高分子物質的產生是顏色變化的主要原因［10-11］，反應時間越長，褐變程度加深。

2.3 糖基化產物游離氨基含量分析

糖基化反應的進程也可以通過測定反應過程中游離氨基含量的變化來證實。

圖2 不同反應時間下糖基化產物游離氨基含量的變化

由圖2可以看出，反應時間的長短對大豆分離蛋白-葡聚糖復合物的影響顯著（P＜0.05）。隨著糖基化反應時間的延長，游離氨基殘留量逐漸減少，表明發生了糖基化反應。在糖基化反應過程中，蛋白質分子中氨基酸側鏈的自由氨基與糖分子中的還原末端的羥基發生了羥胺反應，因此，蛋白質中的游離氨基含量會降低［12］。大豆分離蛋白-葡聚糖復合物在反應的前5 d，時間對反應進程的影響顯著（P＜0.05），游離氨基含量下降速度很快，表明在一定的溫度、濕度下大豆蛋白與葡聚糖之間發生了交聯，糖基化程度加深。

2.4 SDS-PAGE分析

大豆分離蛋白-葡聚糖糖基化產物的SDSPAGE電泳圖譜如圖3所示。

圖3 不同反應時間下糖基化產物SDS-PAGE電泳圖

圖3顯示，隨著糖基化反應時間的延長，電泳圖中分離膠的頂端，電泳條帶的顏色加深，即有大分子的聚合物生成。糖鏈的引入使得與蛋白質發生交聯，反應過程中形成異肽鍵或二硫鍵，生成了一些大分子物質［13］。其次，隨反應時間的增加，電泳條帶有輕微的上移，遷移速率變慢。可見，各個分子質量的蛋白質分子均參與了糖基化反應。此外，隨反應時間的增加，7S各蛋白亞基條帶減弱，可見大豆蛋白中7S組分的反應程度較高。糖基化產物抗原性變化測定發現，糖基化產物中伴大豆球蛋白抗原抑制率降低效果明顯，說明糖基化反應對7S組分影響較大，通過電泳圖印證了這一結果。

2.5 紅外光譜分析

紅外光譜是研究蛋白質-糖類體系很好的方法之一，因為在紅外光譜中特殊辨別的區域中，蛋白質和碳水化合物不存在交叉重疊［14］。大豆蛋白糖基化產物的紅外圖譜如圖4所示。

圖4 糖基化復合物的紅外掃描圖譜

從圖4可以看出，與大豆分離蛋白相比，當蛋白質共價結合糖分子后，蛋白質分子中的羥基增加，在紅外圖譜上表現為3 100～3 500 cm-1區間的吸收峰變寬，另外，共價交聯形成新的N-H鍵導致吸收峰的強度增大，鍵長縮短，伸縮振動波數升高［15］。1 500 cm-1左右處的吸收峰變寬，此處的吸收峰屬于C-N鍵的伸展，蛋白與多糖反應過程中，出現了新的共價鍵基團［14，16］。接著利用PeakFit軟件對糖基化產物的酰胺Ⅰ帶進行去卷積二階導數擬合來計算蛋白二級結構含量的變化，糖基化樣品的二級結構含量變化如表2所示。

從表2可得，經過糖基化改性后，復合物中蛋白質的α-螺旋、β-轉角、無序結構含量減少，同時β-折疊結構含量增加。通常情況下，蛋白質二級結構中的β-折疊通常埋藏在多肽鏈的內部，而糖基化反應的發生，蛋白質中分子間氫鍵遭到破壞，減弱了蛋白質分子間的相互作用力，引起蛋白質分子結構改變［15］；另一方面，糖鏈引入到蛋白質肽鏈中，而糖鏈的空間效應引起了β-折疊結構和無規則結構的變化，交聯的糖蛋白導致蛋白質分子的變化，空間結構展開［17］。單曉紅［18］對大豆蛋白序列的二級結構進行分析發現，β-轉角和無規則卷曲結構在蛋白質序列中的前段有較高頻率的出現，而推測出β-伴大豆球蛋白的α亞基的抗原表位集中在蛋白質序列的前段，β-轉角是凸出結構而且大都出現在蛋白抗原的表面，與抗體結合后很可能形成抗原表位。通過紅外光譜分析發現糖基化產物中β-轉角和無規則卷曲結構含量降低。由此推斷，由于糖鏈的引入，使蛋白質分子展開，空間結構產生變化，β-轉角結構和無規則卷曲結構的含量下降，從而使大豆蛋白的抗原性降低。可見糖與蛋白的結合部位對蛋白質結構變化的影響使蛋白質抗原性發生改變。

表2 糖基化產物中蛋白質的二級結構／%

3 結論

大豆分離蛋白-葡聚糖復合物抗原性隨反應時間的增加而整體上呈降低的趨勢。在反應6 d時，糖基化產物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分別降低了36.90%和18.12%。反應過程中，伴大豆球蛋白受影響較大，抗原抑制率降低效果明顯。隨著反應時間的增加，糖基化產物顏色變化明顯，且游離氨基含量逐漸降低。SDS-PAGE圖中電泳條帶的變化說明大分子物質的生成以及7S組分反應程度較高。紅外光譜掃描發現，糖鏈的引入使蛋白質分子展開，結構中β-轉角和無規則卷曲結構含量降低，影響了大豆蛋白中β-伴大豆球蛋白的α亞基的抗原表位，從而使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反應對抗原性影響的關鍵作用在于糖與蛋白的結合部位對蛋白質結構變化的影響。

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Effects of Glycation Modification on Soybean Protein Antigenicity and Structural Properties

Bu Guanhao Zhu Tingwei Chen Fusheng

（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

Soy protein isolate（SPI）and dextran were used as raw materials and SPI-dextran conjugate were prepared under dry-heated at different times through Maillard reaction in this paper.The antigen inhibition rate of β-conglycinin and glycinin in SPI-dextran conjugate were tested with indirect competitive ELISA method.The antigenicity of β-conglycinin and glycinin decreased 36.90%and 18.12%respectively when the reaction processed at 6 d.Meanwhile，the color deepened and the free amino group content reduced which indicated that different degrees of reaction occurred between soy protein isolate with dextran.FTIR indicated that the protein structure of glycated samples unfolded as the introduced sugar chains.The reduced β-corner and random coil structure content impacted the epitope of β-conglycinin antigen in soybean protein，and then reduced the antigenicity of soybean protein.These showed that the key effect relies on the structure changes caused by the binding site between protein and saccharide.

soybean protein isolate，dextran，glycation，antigenicity，structures

TS21

A

1003-0174（2017）01-0034-06

863計劃（2013AA102208-5），河南省教育廳科學技術研究重點項目（14B550013），國家自然科學基金（31201293）

2015-06-25

布冠好，女，1980年出生，副教授，食品蛋白質資源開發與利用

陳復生，男，1963年出生，教授，食品蛋白質資源開發與利用