油茶籽粕蛋白功能特性及其酶解產物抗氧化活性研究

劉 靜 李 旭 向春蓉 劉 露 馮士令 丁春邦

（四川農業大學生命科學學院，雅安 625014）

油茶籽粕蛋白功能特性及其酶解產物抗氧化活性研究

劉 靜 李 旭 向春蓉 劉 露 馮士令 丁春邦

（四川農業大學生命科學學院，雅安 625014）

采用堿溶酸沉法提取油茶籽粕中的蛋白質，運用正交試驗優化提取的最佳條件，并分析油茶籽粕蛋白功能特性及其木瓜蛋白酶水解物的抗氧化活性。結果表明，在pH 10、料液比1∶30（m／V）、提取時間3 h、提取溫度50℃的最佳條件下，油茶籽粕蛋白的得率為4.99%。油茶籽粕蛋白等電點在pH 5左右。乳化能力、乳化穩定性和起泡能力隨pH增加呈先降后升的趨勢，與蛋白溶解度密切相關。木瓜蛋白酶能有效提高油茶籽粕蛋白溶解性，其蛋白水解物對DPPH·自由基和羥基自由基均具有很好的清除能力（清除率＞85%），對銅離子的螯合能力大于對鐵離子的螯合能力。

油茶籽粕蛋白 蛋白水解物 水解度 功能特性 抗氧化活性

油茶（Camellia oleifera Abel.）為山茶科山茶屬（Camellia）常綠小喬木，是我國特有的一種優良的多年生木本油料植物。油茶籽粕作為油茶種子榨油后的主要副產物，目前主要用作燃料、有機肥或動物飼料，甚至被當作垃圾丟棄，造成資源的極大浪費［1］。因此，充分開發和利用油茶籽粕具有一定的實際意義。

油茶籽粕含有豐富的蛋白質、多糖和皂苷等多種生物活性成分，其粗蛋白質量分數達15%～20%，有17種氨基酸，其中8種是人體必需氨基酸，可用于生產蛋白飲料、沖調食品和食品添加劑［2-3］。用蛋白酶水解油茶籽粕蛋白制備小分子多肽，易被人體消化吸收，不僅能提供人體生長發育所需的營養物質，還具有很強的抗氧化、降血脂、免疫調節和降血壓等生理保健功能［4-5］。目前，多種油料種子餅粕如大豆、油菜、花生和棉籽等，因其含有高品質植物蛋白，廣泛應用于食品工業［6-8］。

本試驗以油茶籽粕為原料，通過正交試驗優化最佳蛋白提取條件，探討油茶籽粕蛋白的溶解性、乳化性和起泡性等功能特性；同時用木瓜蛋白酶水解油茶籽粕蛋白，分析蛋白水解物的抗氧化活性，為開發利用油茶籽粕蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油茶籽粕：雅安太時生物科技有限公司，經干燥、粉碎，過60目篩，備用。2，2-二苯基-1-苦味基肼（DPPH）、1，10-菲啰啉和菲洛嗪：美國Sigma公司；鄰苯二酚紫和三硝基苯磺酸（TNBS）：Kayon生物科技公司。

紫外分光光度計UV-1750：日本島津公司；pH-4C酸度計：成都世紀方舟科技有限公司；FW135高速萬能粉碎機、DZF真空干燥箱：北京永光明醫療儀器廠；RE-2000B旋轉蒸發儀：上海亞榮生化有限公司；SHZ-D循環水式真空泵：鞏義予華儀器有限公司；離心機：德國Thermo公司。

1.2 油茶籽粕蛋白的提取及正交優化

油茶籽粕粉末用正己烷浸提24 h以除去殘余油脂，經75%乙醇浸提5次，每次1 h，以除去皂苷、多酚等物質，干燥備用。在單因素試驗基礎上，選取合適的因素水平進行正交優化（表1）。稱取100 g處理過的油茶籽粕粉末，按試驗設計所給的條件提取蛋白，過濾、離心。上清液用1 mol／L HCl調至pH 4.5，于6 000 r／min離心20 min，得沉淀，經80%乙醇洗滌2次，真空干燥，即得油茶籽粕蛋白并稱重。蛋白質得率＝提取的蛋白質的質量／油茶籽粕粉末質量× 100%。

表1 因素水平表

1.3 油茶籽粕蛋白功能特性測定

1.3.1 蛋白溶解性測定

蛋白溶解度測定方法參照Li等［9］的方法，稍有修改。100 mg樣品溶于10 mL雙蒸水。在相應溫度下，水浴振蕩30 min后，于8 000 r／min離心10 min，取上清，蛋白含量用Lowery法測定［10］。

1.3.2 蛋白乳化性測定

蛋白乳化性測定方法參照Li等［9］的方法，略有修改。一定濃度的樣品溶液用1 mol／L NaOH／HCl調節至一系列的pH值（3～9）。取6 mL蛋白溶液，加入2 mL大豆油，于勻漿機5 000 r／min下攪拌2 min。分別在靜止10 s和10 min后，取下層乳狀液，用0.1%SDS溶液稀釋100倍，充分混勻，于500 nm下測定吸光度，以SDS溶液為空白對照。乳化能力和乳化穩定性計算公式：

乳化能力／m2／g＝（2×2.303A）×100／φC

乳化穩定性＝A0×10／（A0-A10）×100%

式中：A0為靜止10 s時的吸光度；A10為靜止10 min時的吸光度；C為蛋白濃度；φ為油的體積分數。

1.3.3 蛋白起泡性測定

蛋白起泡性測定方法參照Li等［9］的方法，略有修改。一定濃度的樣品溶液用1 mol／L NaOH／HCl調節至一系列的pH值（3～9），定容至20 mL，于5 000 r／min下攪拌2 min。分別在0和30 min后，測定總體積。起泡能力和泡沫穩定性計算公式：

起泡能力＝（A0min-B）／B×100%

泡沫穩定性＝（A30min-B）／（A0min-B）×100%

式中：A0min、A30min分別為攪拌后靜止0、30 min時的總體積；B為攪拌前的體積。

1.4 油茶籽粕蛋白水解物制備及水解度測定

準確稱取油茶籽粕蛋白樣品1.703 g，用適量蒸餾水溶解，加入木瓜蛋白酶54.7 mg，充分溶解混勻，調節pH在6～7范圍內，并定容到80 mL。取7只10 mL EP管編號1～7，分別準確量取10 mL溶液，置于55℃水浴下保溫。保溫時間分別為0.5、1、1.5、2、3、4、5 h。按時間取出，于沸水中煮2 min，室溫放置，備用。

水解度的測定采用Benjakul等［11］的方法，基于α-氨基基團與三硝基苯磺酸（TNBS）反應。1 mL樣品溶于2.0 mL 0.2 mol／L PBS（pH 8.2）和1 mL 0.01%TNBS，黑暗下，于50℃放置30 min；用2.0 mL 0.1 mol／L亞硫酸鈉終止反應，冷卻至室溫，15 min后，于420 nm測定吸光度。水解度計算公式：

水解度＝（As-A0）／（Amax-A0）×100%

式中：As為酶水解蛋白樣品的吸光度；A0為未水解蛋白的吸光度；Amax為經酸完全水解蛋白后（經6 mol／L HCl，100℃水解24 h）的吸光度。

1.5 油茶籽粕蛋白水解物的抗氧化研究

以對DPPH·和羥基自由基清除能力和金屬離子螯合能力作為測定油茶籽粕蛋白水解物體外抗氧化能力的指標。

1.5.1 DPPH·自由基清除活性

采用Li等［9］的分光光度法測定。1.0 mL樣品加入3.0 mL 0.15 mmol／L的DPPH自由基溶液（95%乙醇），搖勻，黑暗室溫反應30 min，517 nm處測定吸光度。DPPH·清除能力參照公式計算：

DPPH·自由基清除率＝［A0-（As-Ah）］／A0× 100%

式中：A0為雙蒸水代替樣品時的吸光度；Ah為雙蒸水代替DPPH溶液的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.5.2 羥基自由基清除活性

采用Zhou等［12］的方法測定。0.4 mL樣品加入到1.5 mL 0.75 mmol／L鄰二氮菲，1.5 mL 0.75 mmol／L FeSO4和0.4 mL 0.1%H2O2，搖勻，于37℃水浴60 min，536 nm處測定吸光度。

羥基自由基清除率＝（As-A0）／（A-A0）×100%

式中：A為雙蒸水替代樣品和H2O2溶液時的吸光度；A0為雙蒸水替代樣品時的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.5.3 鐵離子螯合能力

采用Li等［9］的方法測定。1 mL樣品加入3.7 mL雙蒸水和0.1 mL 2mmol／L FeCl2，搖勻，加入0.2 mL 5 mmol／L菲洛嗪，室溫反應20 min后，于562 nm處測定吸光度。

鐵離子螯合能力＝（A0-As）／A0×100%

式中：A0為雙蒸水代替樣品時的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.5.4 銅離子螯合能力

采用Li等［9］的方法測定。1 mL樣品加入2 mL 0.1%CuSO4溶液和0.5 mL 4 mmol／L鄰苯二酚紫溶液，室溫反應20 min后，于632 nm處測定吸光度。計算公式與鐵離子螯合能力計算公式一致。

1.6 數據統計分析

所有試驗均重復3次，用Origin pro 8.0和SPSS 19.0軟件進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 油茶籽粕蛋白提取工藝優化

在單因素試驗基礎上，以pH值（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）為自變量，以油茶籽粕蛋白得率（Y）為因變量，進行四因素三水平正交試驗設計，試驗結果與分析見表2。由R值分析得出，各因素對油茶籽粕蛋白提取率的影響大小為B＞A＞D＞C，即料液比的影響最大，其次是堿液pH值、提取溫度和提取時間。通過K值可判斷出最佳的提取條件是A2B2C2D2，即pH 10、料液比1∶30（m／V）、提取時間3 h、提取溫度50℃。在此條件下，經驗證蛋白得率為4.99%。堿溶酸沉法是工業生產中常用的種子餅粕蛋白的提取方法，丁丹華等、熊拯等先后用堿溶酸沉法提取了油茶籽粕蛋白，分別得到57.8%和48.59%的提取率［13-14］，本試驗優化后得到4.99%的得率，因為供試材料原因（樣品的粗蛋白質量分數為10.75%），換算為提取率略低于前二者的研究，但其提取率也達到46.42%。

表2 L9（34）正交試驗設計及結果

2.2 油茶籽粕蛋白功能特性分析

2.2.1 蛋白溶解性

蛋白質的溶解性是蛋白質固有的性質，對其應用有著重要的影響。在控制加工溫度的條件下，蛋白質的溶解性與pH值有著密切的關系。

如圖1所示，油茶籽粕蛋白的溶解性隨pH值的變化而變化。在pH 5左右，蛋白溶解度最低，表明油茶籽粕蛋白的等電點在pH 5左右，在偏離等電點的環境中，蛋白均有較高的溶解度。50℃時的蛋白溶解度在pH 3～12下均高于30和70℃時的溶解度，且堿性條件下的溶解度高于酸性條件下的溶解度，在pH 12時的溶解度達82%。一般地，低溫不利于蛋白分子與水分子的相互作用，而高溫則會破壞蛋白分子的空間結構，減弱蛋白分子的穩定性，致使蛋白溶解度降低。在酸性條件下，70℃時的蛋白溶解度與30℃時的溶解度無明顯差異，而堿性條件下低于30℃時的溶解度，表明堿性條件下油茶籽粕蛋白更易受高溫影響。

圖1 不同溫度對油茶籽粕蛋白溶解性的影響

2.2.2 蛋白乳化性與乳化穩定性

乳化性指蛋白質將油水結合在一起形成乳狀液的性能，乳化穩定性是指油水乳狀液保持穩定的能力。蛋白乳化性和乳化穩定性與蛋白質分子的親水和親油基團在分子表面的分布有關，蛋白質變性不同，蛋白質內部疏水基團的暴露程度不同，因此，其乳化性和乳化穩定性也不同［15］。通常，影響蛋白產品乳化性與乳化穩定性的因素有蛋白顆粒的大小、蛋白質的濃度、溶液的pH值、溫度等。

圖2a、圖2b為室溫條件下pH值和蛋白濃度對乳化性和乳化穩定性的影響。圖2c、圖2d為蛋白濃度為1.5 mg／mL時pH值和溫度對乳化性和乳化穩定性的影響。

從圖2a、圖2b可以看出，油茶籽粕蛋白的乳化能力隨pH值的增加呈先降后升的趨勢，接近蛋白的等電點（pH 5左右）時，蛋白的溶解性最低，乳化性質也低。蛋白的乳化活性與它的溶解度的關系密切，偏離等電點時，pH增加可以提高蛋白的溶解性，分子中的疏水基團暴露，促進了乳化形成。蛋白濃度和溫度對乳化能力也有影響，高質量濃度蛋白（1.5 mg／mL）對油茶籽粕蛋白的乳化能力有一定的抑制作用，蛋白濃度為1.0 mg／mL、pH 9時有最好的乳化能力（371.5 m2／g）（圖2a）。在pH 5時，油茶籽粕蛋白在70℃時乳化能力最差，在50℃時乳化能力最高；在遠離pH 5環境中，50和70℃時均具有良好的乳化能力，溫度為50℃、pH 9時乳化能力達到248.5 m2／g（圖2c）。

圖2 油茶籽粕蛋白乳化性能

圖2b、圖2d顯示，隨著pH值的增加，油茶籽粕蛋白的乳化穩定性呈先降后升再略有下降的趨勢，在蛋白的等電點（pH 5左右）時乳化穩定性最差，在pH 7時最好，當pH大于7時，乳化穩定性降低，可能是由于溶解度增加，疏水基團暴露，蛋白的黏度降低導致。pH影響蛋白分子弱酸、弱堿性基團從而影響蛋白分子的構象及理化性質，使濃度和溫度對蛋白乳化性能的影響因酸堿環境的不同而異［16］。在pH 3時乳化穩定性隨濃度增加而減小，而在pH 7時則隨濃度增加而增加，在pH≥5時高濃度蛋白比低濃度表現出更強的乳化穩定性（圖2b）。從圖2d可以看出，油茶籽粕蛋白乳化穩定性隨溫度升高而升高，在70℃、pH 7時，乳化穩定性達77.6%。

2.2.3 蛋白起泡性

起泡性是蛋白質攪打起泡的能力，蛋白質泡沫是蛋白質在一定條件下與水分、空氣形成的一種特殊形態的混合物。泡沫穩定性是指泡沫保持穩定的能力。蛋白質的起泡性和泡沫穩定性與蛋白質濃度、pH、溶解度、溫度等有密切關系。

圖3a、圖3b為室溫條件下pH值和蛋白濃度對起泡性和泡沫穩定性的影響。圖3c、圖3d為蛋白濃度為1.5 mg／mL時pH值和溫度對起泡性和泡沫穩定性的影響。

如圖3所示，油茶籽粕蛋白的起泡能力隨pH值的增加呈先降后升的趨勢，在等電點附近蛋白溶解度最低，蛋白起泡能力也最低，而泡沫穩定性則隨pH值的增加呈先升后降的趨勢，在pH為7時泡沫穩定性最好，與菜籽蛋白、牡丹籽蛋白等油料蛋白的研究結果相似，表明中性環境有利于蛋白的泡沫穩定性［17-18］。

圖3a顯示，油茶籽粕蛋白起泡能力隨蛋白濃度的增加而增加。在pH≥5環境中，高質量濃度（≥1.0 mg／mL）的蛋白起泡能力增加不明顯（P＞0.05），并抑制泡沫穩定性，而低濃度的蛋白則具有良好的泡沫穩定性。質量濃度為0.5 mg／mL、pH 7時，泡沫穩定性最好，達82.3%（圖3b）。盛彩虹等［19］對紫蘇蛋白的起泡性和泡沫穩定性分析認為紫蘇蛋白的起泡性和泡沫穩定性都隨蛋白質濃度的增大而增大，而本試驗顯示僅起泡性隨蛋白質濃度的增大而增大，這可能與蛋白質種類和性質不同有關。

圖3c顯示，弱酸（pH 5）和中性環境中，溫度對蛋白起泡能力的影響不顯著，但在強酸強堿性（pH 3或pH 9）環境中，蛋白起泡性隨溫度增加而增加。圖3d顯示，低溫（30℃）、中性環境（pH 7）時蛋白泡沫穩定性最高，高溫（70℃）或強酸強堿性（pH 3或pH 9）均顯著抑制蛋白泡沫穩定性，因為泡沫穩定性受蛋白變性程度的影響［20］。結果顯示，低質量濃度（0.5 mg／mL）、低溫（30℃）、中性環境（pH 7）時油茶籽粕蛋白的起泡能力和泡沫穩定性綜合表現優良。

圖3 油茶籽粕蛋白起泡性能

2.3 油茶籽粕蛋白水解度及溶解性分析

利用木瓜蛋白酶水解油茶籽粕蛋白，由圖4顯示，蛋白水解度和溶解性均隨水解時間延長而增加，在開始水解1.5 h內增長迅速，水解度從0.5 h的9.1%迅速增加到1.5 h的15.9%，蛋白溶解度從71.6%迅速增加至82.1%，而后，溶解度增加減緩，到水解結束時（5 h），其水解度為22.8%，溶解度為88.6%（圖4）。隨著水解時間的延長，酶解反應充分，水解度增加，因產生更多的多肽片段，增加了蛋白溶解性。

圖4 水解時間對油茶籽粕蛋白水解度及溶解性的影響

2.4 油茶籽粕蛋白水解物抗氧化活性分析

自由基具有細胞毒性，能破壞細胞膜，損傷蛋白質，導致DNA突變，修飾低密度脂蛋白，還能氧化油脂導致食品變質和營養流失［5，9］。由圖5所示，油茶籽粕蛋白水解物對DPPH·自由基和羥基自由基均有較好的清除能力，其清除率均＞85%。隨水解時間增加，DPPH·自由基清除活性增加，從0.5 h的86.8%增加至水解結束時的97.2%，而羥基自由基清除活性則呈先增加后減少的趨勢，在2 h時的清除率最高（92.9%）。

圖5 油茶籽粕蛋白酶解產物自由基清除活性與金屬螯合能力

過渡金屬離子如鐵離子、銅離子等能催化自由基的產生導致氧化加速，因而螯合過渡金屬離子能夠延緩自由基的產生，延遲氧化［9，12］。由圖5所示，隨水解時間增加，油茶籽粕蛋白水解物對鐵離子螯合能力呈先降后升趨勢，而對銅離子螯合能力無顯著影響，維持在45%左右，表明不同水解時間水解出的肽類不同，對金屬離子的螯合能力不同。對鐵離子的螯合能力在水解2 h時最低（12.6%），在5 h時最高（42.2%），均低于對銅離子的螯合能力。

3 結論

3.1 經正交試驗優化出了油茶籽粕蛋白的最佳提取條件：pH 10、料液比1∶30（m／V）、提取時間3 h、提取溫度50℃，此條件下的蛋白得率為4.99%。

3.2 油茶籽粕蛋白的等電點在pH 5左右，其蛋白溶解度最低；50℃時的蛋白溶解性較高，且堿性條件下的溶解度更高，在pH 12時溶解度達82%。濃度和溫度對蛋白功能特性的影響因pH值的不同而不同，乳化能力和起泡能力在pH 9時最好，乳化穩定性和泡沫穩定性在pH 7時最好。高濃度（1.5 mg／mL）對蛋白的乳化能力和泡沫穩定性起抑制作用。高溫（70℃）增加了乳化穩定性，抑制了泡沫穩定性。

3.3 木瓜蛋白酶水解油茶籽粕蛋白能有效提高蛋白溶解性，其蛋白水解物對DPPH·自由基和羥基自由基均具有很好的清除能力（清除率＞85%），對金屬離子螯合能力受水解時間和離子類型的影響，對銅離子的螯合能力大于對鐵離子的螯合能力。

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Functional Properties of Camellia Oleifera Seed-Cake Protein and Antioxidant Activity of Its Enzymatic Hydrolysate

Liu Jing Li Xu Xiang Chunrong Liu Lu Feng Shiling Ding Chunbang

（College of Life and Science，Sichuan Agricultural University，Yaan 625014）

The extraction of protein from Camellia oleifera seed-cake by alkali-soluble acid precipitation was used in order to optimize extraction conditions of C．oleifera seed-cake protein（SCP）by orthogonal experimental design.Meanwhile，the functional properties of SCP and antioxidant activity of its hydrolysate prepared by papain were evaluated.Results showed that the optimum extraction conditions were pH 10，material-liquid ratio 1∶30（m／V），temperature 50℃ and time 3 h，based on which SCP yield was 4.99%.SCP isoelectric point was at around pH 5. As pH increased，emulsifying capacity and stability and foaming capacity of SCP presented an initial drop and subsequent rise，positively correlating with protein solubility.Papain treatment improved the protein solubility effectively. Papain-treated hydrolysate possessed excellent DPPH and hydroxyl radical scavenging activity both with above 85%，and copper chelating capacity was stronger than iron chelating capacity.

Camellia oleifera seed-cake protein，protein hydrolysate，hydrolysis degree，functional properties，antioxidant activity

TQ936.2

A

1003-0174（2017）01-0040-07

四川省科技廳科技支撐計劃（2013NZ0047）

2015-05-25

劉靜，女，1978年出生，博士，植物資源保護與利用

丁春邦，女，1966年出生，教授，植物資源評價與利用