天山云杉成熟與未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導及增殖研究

伊麗米努爾，李宏

(新疆林業科學院造林治沙研究所，烏魯木齊 830063)

天山云杉成熟與未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導及增殖研究

伊麗米努爾，李宏

(新疆林業科學院造林治沙研究所，烏魯木齊 830063)

【目的】研究天山云杉成熟與未成熟合子胚的胚性愈傷組織誘導及增殖條件技術，對該樹種的胚胎發生機理和建立相關的快繁技術體系奠定了基礎?！痉椒ā恳詭呷楹筒粠呷榈奈闯墒旌献优呒俺墒旌献优邽橥庵搀w，在不同生長調節劑濃度的DCR培養基上進行誘導培養。對不同生長時期合子胚的胚性愈傷組織誘導率和增殖量進行研究。【結果】(1)添加不同生長調節劑(2,4-D、6-BA、TDZ)濃度組合的DCR培養基上誘導成熟合子胚時，20 μM 2,4-D和5 μM 6-BA為最佳組合濃度，胚性愈傷組織誘導率最高，為55%。(2)對不同采樣時間的三種合子胚胚性愈傷組織誘導率進行分析表明，帶胚乳的未成熟合子胚(6月)為32.6%，成熟合子胚(9月)為60.6%，不帶胚乳的未成熟合子胚(7月)為83.1%，7月為天山云杉胚性愈傷組織誘導的最佳采摘期。(3)胚性愈傷組織在不同5種培養基上增殖培養表明，培養基之間增殖量差異顯著(P<0.05)。BM2和SH培養基的增殖效果明顯優于MSG，1/2DCR，DCR，以SH的綜合增殖效果最好，其增殖量為4.55 g，增殖率為600%。(4)5種個體胚性愈傷組織在SH培養基上增殖培養表明，個體之間增殖量變化不明顯(P>0.05)?！窘Y論】建立了天山云杉胚性愈傷組織發生技術平臺，為天山云杉遺傳改良種質創新、縮短育種周期奠定了研究基礎。

天山云杉；培養基；生長調節劑；胚性愈傷組織

0 引 言

【研究意義】天山云杉(PiceaschrenkianaFisch. et Mey.)屬松科云杉屬，為中亞和亞洲中部山地特有種，在中國僅分布于天山，是新疆山區最重要的森林樹種之一，面積約52.84×104hm2，占全疆天然有林地總面積44.9%[1-2]，是新疆山地森林中分布最廣、蓄積量最大、經營活動最多、用途最廣、材質優良的主要用材樹種，對天山的水源涵養、水土保護、林區生態系統的形成和維護發揮著不可替代的作用[3]。研究天山云杉胚性愈傷組織發生及增殖培養技術，對該樹種的胚胎發生機理和建立相關的快繁技術體系等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】由于天山云杉分布區人類活動頻繁及不合理的經營管理和林牧矛盾等因素造成天山云杉林生態系統結構嚴重受損，導致了天山云杉林的衰退[4]。天然更新不良或天然更新困難等問題的出現已成為長期困惑林業工作者的一大難題。云杉樹種生長較慢，種子成熟率很低，繁殖和品種選育有很大困難[5]。從種子萌發到長成可以移栽的小苗，又需經過4～5a，所以通過自然繁殖進行育種和選擇優良基因型效率太低。采用嫁接、扦插等營養繁殖的方法既消耗大量的時間和勞動力，又受季節的限制。體細胞胚發生是指在離體條件下植物的體細胞通過與合子胚發生相類似的途徑發育成新個體的過程[6-8]。植物體細胞胚胎發生不僅可作為其繁育的重要手段，而且也是研究胚胎發育過程的一種重要模式系統[9-11]。【本研究切入點】目前天山云杉主要通過有性繁殖產生后代，無性繁殖一直受到各國林業決策部門的重視與林木育種工作者以及森林經營者的特別關注，尤其是現代生物技術的蓬勃發展，如植物組織培養及體細胞胚胎發生技術，具有繁殖效率高、周期短、不受自然條件制約、穩定和選育優良品種，對造林工程具有重大意義等特點[12-14]。【擬解決的關鍵問題】以帶胚乳和不帶胚乳的未成熟合子胚及成熟合子胚為外植體，研究天山云杉胚性愈傷組織誘導及增殖的完整發育過程，并對影響天山云杉胚性愈傷組織誘導的因素如種子采摘期和培養基及生長調節劑等進行研究，建立天山云杉胚性愈傷組織誘導和增殖的技術平臺，為天山云杉遺傳改良種質創新、縮短育種周期奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

采樣地點為新疆烏魯木齊市水西溝。采樣時間為：分別于2013年6月26日采集天山云杉球果(帶胚乳的未成熟合子胚)、7月25日采集天山云杉球果(即不帶胚乳的未成熟合子胚)、9月10日采集成熟種子(即成熟合子胚)作為材料。

1.1.3 材料不同發育階段的合子胚的形態結構

合子胚的不同發育期是培養物誘導的一個重要因素。圖1

a、b：成熟種子；c、d：成熟合子胚；e-g：未成熟球果；h-j：未成熟種子；k-l：未成熟合子胚；規格：1 mm(b，c，d，i，j)；100 μm (k,l)

a、b：mature seeds; c、d：mature zygotic embryos；e-g：immature cones；h-j：immature seeds；k-l：immature zygotic embryos；Standard: 1mm(b，c，d，i，j)；100 μm (k，l)

圖1 天山云杉種子及其成熟與未成熟合子胚
Fig.1 The seeds and mature and immature zygotic embryos ofP.schrenkiana

1.2 方 法

1.2.1 天山云杉胚性愈傷組織誘導培養基及制備

試驗選用的誘導培養基為DCR[15]培養基。制備時，每升添加30 000 mg蔗糖+不同生長調節劑濃度組合，pH值5.8±0.02，添加3 000 mg/L Gelrite(卡拉膠)為固化劑。在121℃，2×107Pa的壓力下進行15 min高壓滅菌，高壓滅菌后，培養基溫度冷卻到60℃時，添加700 mg過濾滅菌的谷氨酰胺。6種誘導培養基篩選天山云杉胚性愈傷組織誘導的最佳生長調節劑濃度組合。以DCR1培養基作為對照。表1

表1 不同生長調節劑濃度組合的DCR誘導培養基
Table 1 DCR induction medium with different growth regulator concentrations

DCR：培養基DCR：Medium生長調節劑類型Differentgrowthregulator生長調節劑比例GrowthregulatorratioDCR10μM2，4-D0μM6-BA0DCR210μM2，4-D5μM6-BA2：1DCR320μM2，4-D5μM6-BA4：1DCR420μM2，4-D10μM6-BA2：1DCR540μM2，4-D10μM6-BA4：1DCR620μM2，4-D10μMTDZ2：1

1.2.2 天山云杉胚性愈傷組織增殖培養基制備

采用DCR、1/2DCR、SH、BM2和MSG 5種不同的增殖培養基，5種培養基均添加生長調節劑1.10 mg/L 2,4-D和0.44 mg/L 6-BA。

1.2.3 消毒與接種

1.2.3.1 種子

將種子用質量百分濃度為0.2%的HgCl2溶液消毒5 min后，用無菌水沖洗3次，接種備用；在超凈工作臺上用消毒攝子和解刮刀縱裂種子，分離合子胚，將合子胚接種于各種培養基上，觀察胚性愈傷組織的誘導情況。

1.2.3.2 球果

將球果用質量百分濃度為0.2%的HgCl2溶液消毒10 min后，用無菌水沖洗3次。在超凈工作臺上用消毒攝子和解刮刀從球果中剝去未成熟種子，從側部劃開種殼，取出種仁，劃破內種皮，挑開胚乳，將6月采集的未成熟合子胚同胚乳一起和7月采集的未成熟合子胚及9月的成熟合子胚接種于各種培養基上。

1.2.3.3 接種方法與條件

3種合子胚在每培養皿接種4個，重復15次，在溫度23～25℃下暗培養4～10周。

1.2.3.4 增殖繼代培養

每15～20 d增殖繼代一次。

1.2.3.5 增殖量

每皿增殖培養基上接種0.65 mg胚性愈傷組織(分成4塊接種到增殖培養基上)進行培養，重復5次。胚性愈傷組織的增殖過程在溫度為(23±2)℃下暗培養與誘導階段相同，分別為0，7，14，21，28，35，42，49，56 d后稱增殖量，并統計胚性愈傷組織增殖情況。

1.2.3.6 指標測定

污染率(%)=污染外植體數量/接種外植體總量×100%；

愈傷組織誘導率(%)=產生胚性愈傷組織的外植體數/接種外植體總數×100%。

1.3 數據統計

用Excel 2003和prism 5.0 分析軟件進行差異顯著性分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 3種合子胚對胚性愈傷組織的誘導過程

不同發育階段的3種合子胚分別接種到DCR3培養基上誘導。分不同發育階段觀察記錄產生愈傷組織的數量、色澤和質地，辨別其為胚性愈傷還是非胚性愈傷組織。研究表明，培養5個星期后合子胚開始形成愈傷組織(圖2c)，培養10個星期后生長迅速的白色絲狀透明的胚性愈傷組織(圖2d，h，i)和堅硬的顆粒狀黃褐色非愈傷組織(圖2n，o)，隨培養時間的延長后褐化死亡。一般愈傷組織分成2大類：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織通過發育可以分化，可以形成苗木。而非胚性愈傷組織不能分化，不能形成苗木。圖2

a-d：帶胚乳的未成熟合子胚(未完全形成合子胚)；a：接種第1 d；b：培養2個星期；c：5個星期后種胚開始形成愈傷組織；d，h，i：培養10個星期后生長迅速的白色絲狀透明的胚性愈傷組織；e：分離合子胚后的胚乳；f：不帶胚乳的未成熟合子胚(合子胚胎發育階段I)；g：成熟合子胚(合子胚胎發育階段III)；j-m：顯微鏡放大后胚性愈傷組織；n，o：黃褐色非胚性愈傷組織；p：非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織；E：胚發育階段I；S：胚根；比例尺：1 mm(a-i)；0.5mm (j, k, l, m)；3 mm (n-p)

a-d: immature zygotic embryos(ZE) without endosperm younger than Phase I; a: freshly prepared; b: after 2 Weeks of culture; c: after 5 weeks with beginning SE; d, h, i: after 10 weeks with advanced development of SE; e: open ZE with endosperm; f: isolated ZE Phase I; g: isolated ZE Phase III; j-m: Details of SE; n, o：callus formation in isolated ZE; p: Callus formation and SE; E: Phase I with embryo; S: Suspensor; Scale bar: 1 mm (a-i); 0,5 mm (j, k, l, m); 3 mm (n-p)

圖2 天山云杉胚性愈傷組織誘導的顯微下觀察
Fig.2 Observation Microscopy of induced somatic embryogenesis (SE) ofP.Schrenkiana

2.2 6種誘導培養基對成熟合子胚胚性愈傷組織誘導

天山云杉成熟合子胚在6種培養基上誘導培養。研究表明，在DCR6和DCR3培養基上誘導率較高，分別為45%和55%。在DCR5和DCR4培養基的誘導率較低，分別為35%、32.5%。在DCR2培養基上誘導率最小為18%。通過方差分析的結果表示，DCR6和DCR3比其他培養基之間差異顯著(P<0.05)。表現出生長調節劑濃度組合的優勢。其他培養基之間的差異不顯著(P>0.05)。6種培養基誘導率的高低排序為DCR3> DCR6> DCR5> DCR4> DCR2> DCR1。圖3

2.3 不同發育階段的合子胚在DCR3上的誘導

不同發育階段的3種合子胚分別在DCR3培養基上誘導培養。產生的胚性愈傷組織總數占接種外植體總數的百分率來表征天山云杉3種合子胚誘導胚性愈傷組織的誘導率，研究表明，7月采集的合子胚誘導率最高為為83.1%，9月采集的合子胚誘導率為60.6%，6月采集的合子胚誘導率最底為32.6%；通過非胚性愈傷組織統計結果表示，6月采集的合子胚誘導率為10.6%、7月采集的合子胚誘導率為6.8%和9月采集的合子胚誘導率為40%。誘導過程中每天統計污染率表明，9月10日采集的合子胚污染率最高，達36.5%，其他2種合子胚的污染率為5%。表3

對胚性愈傷組織誘導率進行方差分析，結果表示，不同發育階段的合子胚對胚性愈傷組織的誘導呈顯著性差異 (P<0.05)。7月采集誘導胚性愈傷組織的誘導率高、非胚性愈傷組織率低、質量好、污染少、增殖力強比其他2種合子胚。

2.4 增殖培養基對胚性愈傷組織增殖

將胚性愈傷組織接種于5種不同培養基上增殖培養，研究表明，5種培養基其增殖量與增殖率表現出不一樣的變化，試驗數據統計結果表示，BM2和SH培養基的增殖量高于其他培養基，分別為5.74 g和為4.55 g，增殖率達到782.7%和600%。其他3種培養基(MSG、DCR、1/2DCR)的增殖率低，分別為3.41 g、2.69 g、2.61 g，增殖率達到424.4%、313.2%、301.5%。通過原始統計數據進行方差分析、顯著性檢驗，結果表示，BM2和SH培養基的增殖量顯著差異(P<0.05)。其他3種培養基之間無顯著差異(P>0.05)。增殖量的高低排序為BM>SH>MSG>DCR>1/2DCR。BM2和SH培養基的增殖效果明顯優于其他3個培養基。雖然BM2培養基的增殖效果最好，但其繼代一次后褐化現象嚴重。SH培養基繼代培養后能夠保持較好的胚性，褐化現象較少。在SH培養基中谷氨酰胺含量比BM培養基的一半，谷氨酰胺是一種特殊的營養物質，可能影響SH培養基的增殖率。圖4

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: same letter indicate no significant difference(P>0.05), difference letter indicate significant difference(P<0.05)

圖3 不同生長調節劑濃度組合下天山云杉胚性愈傷組織誘導率變化
Fig.3 Effects of different combinations of growth regulator concentrations on the induction rate of somatic embryogenesis ofP.Schrenkiana
表3 天山云杉種子(含球果)不同采種期的合子胚誘導產生胚性愈傷組織狀況
Table 3 Induction of SE inP.schrenkianawith different collection time

采集日期AcquisitionDate接種數(個)Numberofvaccination污染死亡數(個)Pollutiondeaths剩余數(個)Remaininggrains污染死亡率(%)Pollutionmortality無反應數(個)Numberofnoreactions非胚性愈傷數(個)Non-embryogenicnumber胚性愈傷數(個)Embryogenicnumber胚性愈傷組織誘導率(%)Embryogeniccallusinductionrate201362620010190510820623262013725200101905191315883120139102007312236506067530

2.5 不同天山云杉個體胚性愈傷組織在增殖培養基上增殖變化

選取了5個天山云杉個體胚性愈傷組織(T6，T7，T36，T43，T48)，接種在SH培養基上觀察增殖情況(圖5B)。研究表明，5種不同個體胚性愈傷組織增殖量變化不明顯(圖5A)，5種個體的增殖量分別為4.63 g、4.56 g、4.50 g、4.11 g、4.09 g。高低排序為T6>T36>T48>T43>T7。通過方差分析結果表示，各個體之間增殖量無顯著性差異(P>0.05)。圖5

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: same letter indicate no significant difference(P>0.05), difference letter indicate significant difference(P<0.05)

圖4 誘導天山云杉胚性愈傷組織增殖的最適培養基選擇
Fig.4 Selection of the optimum medium for inducing somatic embryogenesis proliferation ofP.schrenkiana

注：圖5B中：a、b：增殖培養基的胚性愈傷組織；c：胚性胚柄團的顯微結構觀察；d：胚性愈傷組織的顯微結構觀察, 比例尺：10 mm(a，b)；100 μm (g，d)

Note:
Fig. 5B: a，b: somatic embryogenesis Proliferation medium; c: microstructure of embryonic suspensor group; d: microstructure of somatic embryogenesis, Scale bar: 10 mm (a, b); 100 μm (g, d)

圖5 不同基因型胚性愈傷組織在SH培養基上的增殖情況
Fig.5 Proliferation of different somatic embryogenesis in SH

3 討 論

植物體胚發生是植物界普遍存在的一種現象，在快速繁殖、人工種子、種質資源保存、突變體的誘變和篩選、植物基因工程等許多方面有廣闊的應用前景和巨大的潛在經濟價值[16-18]。自從1958年在胡蘿卜組織培養中發現了一種與胚相似的結構以來，目前能離體再生的植物達1 000多種，并有逐年上升的趨勢，說明在植物界體細胞胚胎發生是一種較為普遍的現象[19]。通過體細胞胚胎發育途徑實現植株再生不僅可以解決無性繁殖的問題，對于生物技術在云杉屬中的具體應用及其樹種的品質改良也具有十分重要的意義。在天山云杉體細胞胚胎發生過程中，經由組織培養方法誘導愈傷組織，并由愈傷組織獲得體細胞胚胎，是目前人工種子研究和生物技術中廣泛應用的手段之一[20-22]。

不同濃度的2,4-D、6-BA和TDZ組合對誘導胚發生愈傷組織的效率也不同[23]，因此，確定天山云杉胚性愈傷組織誘導的最佳培養基和生長調節劑濃度至關重要。添加不同濃度的2,4-D和6-BA或TDZ的DCR培養基上誘導成熟合子胚時，20 μM 2,4-D 和5 μM 6-BA為最佳生長調節劑濃度組合，胚性愈傷組織誘導率最高，達到55%。這與孫敬爽等[24]研究的北美藍云杉體細胞胚胎發生的生長素濃度相比濃度較低，進一步說明不同種類的云杉體細胞胚胎發育的需要的生長素濃度不同。不同發育階段的3種合子胚分別在DCR3(20 μM 2,4-D和5μM 6-BA)培養基上誘導培養表明，帶胚乳的未成熟合子胚(6月26日)為32.6%，成熟合子胚(9月10日)為60.6%，不帶胚乳的未成熟合子胚(7月25日)為83.1%。不同發育階段的合子胚對胚性愈傷組織的誘導呈顯著性差異，6月采集的合子胚在誘導過程中，54%的合子胚沒有反應，誘導率低于7月采集的合子胚。而9月采集的合子胚污染率和非胚性愈傷組織率高，分別為36.5%和30%，誘導率低于7月采集的合子胚。7月采集的合子胚污染率低，誘導率高，增殖力強，胚性愈傷組織誘導的最佳采摘期。這與Carneros[25]，等得到的結論一致。為今后體細胞胚胎發育研究奠定了基礎。通過天山云杉種子成熟的不同發育階段(帶胚乳的未成熟合子胚，不帶胚乳的未成熟合子胚，成熟合子胚)的胚性愈傷組織的誘導是完全可能的；天山云杉胚性愈傷組織的誘導率的高低與種子采摘時間密切相關。

供試的5種培養基對胚性愈傷組織的增殖效果不同，BM2和SH培養基的增殖效果明顯優于MSG，1/2DCR，DCR。其中BM2培養基的胚性愈傷組織增殖效果最為明顯，其增質量達到5.74 g，但BM2增殖的胚性愈傷組織增殖效果最好，但其繼代一次后易褐化。不同基礎培養基上的不同胚性愈傷組織的增長量表明，BM2增殖培養基上的不同胚性愈傷組織的增殖量最高，其次是SH培養基，愈傷組織增殖量為4.55 g，增殖率達到600%。由于以SH為基本培養基進行增殖培養的胚性愈傷組織在繼代培養后能夠較好的保持胚性，且繼代后褐化現象較少。獲得良好增殖的胚性愈傷組織，外觀顏色呈現淡黃色，增殖培養1～2個月后，有的愈傷組織會出現一些褐變，因此，為提高胚性愈傷的增殖倍數，如何延長增殖培養時間以及如何促進和提高增殖培養的倍數，則是其后的研究需要進一步深入的研究課題。這與Klimaszewska[26]等研究結論一致。

研究對影響天山云杉胚性愈傷組織誘導的因素如種子采種期、培養基和生長調節劑等進行探討，并建立了天山云杉胚性愈傷組織發生技術平臺。天山云杉胚性愈傷組織的誘導與增殖的可行性，為研究天山云杉遺傳改良種質創新和縮短育種周期奠定了堅實基礎。

4 結 論

4.1 以天山云杉成熟合子胚誘導胚性愈傷組織，DCR作為基礎培養基添加20 μM 2,4-D和5 μM 6-BA(4:1)為最佳培養基，胚性愈傷組織誘導率最高，達到55%。

4.2 3種不同發育階段的合子胚在DCR3培養基中，7月25日采集的未成熟合子胚的誘導率最高，達到83.1%，為胚性愈傷組織誘導的最佳外植體。

4.3 在BM2、SH、MSG、1/2DCR、DCR 5種培養基中，SH是增殖胚性愈傷組織的綜合增殖效果最佳，增殖量從0.65 mg提高到4.55 g，增殖率為600%。

4.4 不同個體胚性愈傷組織在SH培養基上增殖培養，表明個體之間增殖量變化不明顯。

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Supported by:Supported by Natural Science Fund of Xinjiang Uygur Autonomous Region"Related research on the somatic embryogenesis of Picea schrenkiana"(2013211A036)

Study on the Induction and Proliferation of Somatic Embryogenesis from the Mature and Immature Zygote Embryos ofPiceaschrenkiana

Yiliminuer，LI Hong,

(ResearchInstituteofAfforestationandDesertificationPreventionandControl,XinjiangAcademyofForestrySciences，Urumqi830063,China)

【Objective】 To study the induction and proliferation of somatic embryogenesis from the mature and immature zygote embryos ofPiceaschrenkiana, which might have great significance for the understanding of the mechanism of embryonic development and the establishment of rapid propagation system.【Method】Immature embryo and mature embryo were used as explants to induce culture in DCR medium with different growth regulator concentrations. The induction rates of zygotic embryos in different growth stages and its proliferation were studied using immature zygotic embryos with endosperm, immature zygotic embryos without endosperm and mature embryos as explants.【Result】(1) When DCR medium added with different concentrations of 2,4-D and 6-BA was used to induce mature zygotic embryos, the combination of 20 μM 2,4-D and 5 μM 6-BA was the best and somatic embryogenesis induction rate was the highest, up to 55%. (2) The induction rate of three zygotic embryos of somatic embryogenesis collected in different periods showed that the immature zygotic embryos with endosperm (June) was up to 32.6%, the mature zygotic embryos (September) was up to 60.6%, Immature embryo without endosperm (July) was 83.1%, which indicated that July was the best picking period ofP.schrenkianacones. (3) The somatic embryogenesis in the five different proliferation medium showed the the proliferation rate was significant (P< 0.05). The proliferation results of somatic embryogenesis in different proliferation medium showed that the effect of BM2 and SH were better than the MSG, 1/2DCR, DCR, and the comprehensive proliferation effect of SH was the best. The proliferation rate was 4.55 g and the rate was up 600%.) (4) The five different somatic embryogenesis in SH proliferation medium showed that the difference between somatic embryogenesis was not significant (P> 0.05).【Conclusion】This study has established the somatic embryogenesis technology platform ofP.schrenkianafor the first time, which has provided a scientific basis for the genetic improvement of germplasm and shortened the breeding cycle ofP.Schrenkiana.

Piceaschrenkiana; culture media; plant growth regulator; somatic embryogenesis

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.008

2016-11-23

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目“天山云杉體細胞胚胎發育的相關研究”(2013211A036)

伊麗米努爾(1964-)，女，塔城人，副研究員，博士，研究方向為逆境生理生態、良種選育等，(E-mail)1045230278@qq.com

李宏(1962-)，男，伊犁人，研究員，博士，研究方向為森林培育等，(E-mail)1900284827@qq.com

S791.18

A

1001-4330(2017)02-0262-10