綿羊eIF3h基因克隆、原核表達及蛋白鑒定

于常江，祁成年，張云生，沈敏，楊華，楊永林

(1.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆石河子 832000)

綿羊eIF3h基因克隆、原核表達及蛋白鑒定

于常江1，2，祁成年1，張云生2，沈敏2，楊華2，楊永林2

(1.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆石河子 832000)

【目的】克隆綿羊真核翻譯起始因子eIF3h，構建原核表達載體，并誘導外源蛋白表達，檢測、鑒定帶有His標簽的目的蛋白?！痉椒ā扛鶕礼enbank中綿羊eIF3h基因CDS序列設計引物，PCR特異擴增DNA片段，酶切、連接至pET28α(+)載體，將重組質粒轉入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)株中誘導eIF3h蛋白表達。采用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達情況，利用Western blot技術檢測、鑒定目的蛋白。【結果】正確、完整的克隆到綿羊eIF3h基因CDS區序列，片段全長1 059 bp。將重組質粒轉入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株后，在37℃，1 mmol/L濃度的IPTG誘導3.5 h后獲得以包涵體形式存在的目的蛋白，分子量大小約為40 kD。【結論】獲得了完整、正解的綿羊eIF3h基因CDS區序列片段，構建了該基因的原核表達載體，成功誘導了綿羊eIF3h基因外源表達的目的蛋白，為綿羊eIF3h基因的后續研究提供了科學數據。

綿羊；eIF3h基因；基因克?。惠d體構建；原核表達

0 引 言

【研究意義】羊毛品質是影響綿羊經濟價值的重要因素之一，研究和闡明羊毛生長發育的機制將為羊毛細度、長度、密度等性狀的提升起到重要作用，有利于增強新疆未來細羊毛的競爭力和市場價格。在生物體生長發育調控機制中，真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factor)參與了眾多蛋白質合成、細胞生長發育的過程，是一類能夠確保形成正確的mRNA-核糖體復合物，從而調節蛋白質合成，維持細胞生長的蛋白質[1]。eIF3h基因(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit h)作為eIF3家族重要的亞基之一[2-3]，分子量為40 kD，故也稱為eIF3p40或eIF3S3，人類定位于染色體8q23上[4]，而綿羊定位在染色體9號上，其主要作用是參與蛋白質翻譯及對細胞周期進行調控，從而影響蛋白質合成和調節細胞生長。了解該基因在羊毛成長發育過程中的作用，改良綿羊經濟性狀，更好的對繁殖育種工作產生積極的影響?！厩叭搜芯窟M展】實驗室前期工作中發現該基因在粗細毛羊種間存在較高表達差異。同時有研究表明，eIF3h基因在人類多種惡性腫瘤中存在高表達現象[5-7]，反映其與人類多種腫瘤的發生、發展密切相關，繼而推測其可能參與羊毛生長發育的相關過程。【本研究切入點】為揭示eIF3h基因在粗、細毛羊的對羊毛生長發育的影響，明確其調控機制和功能，了解綿羊eIF3h基因的表達序列信息和體外蛋白表達情況就顯得尤為重要。實驗主要對目的基因CDS區片段進行克隆，并構建其表達載體，使目的蛋白得到準確表達?！緮M解決的關鍵問題】試驗完整克隆eIF3h基因CDS序列片斷，再在原核表達系統誘導表達重組蛋白，驗證序列的正確性，為綿羊eIF3h基因的功能研究提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質粒及實驗動物

實驗所用菌株(BL21、DH5α)、原核表達載體pET28α(+)為實驗室保存，實驗動物為美利奴細毛羊(軍墾型)。

1.1.2 主要試劑

RNA提取及反轉錄試劑盒購自Invitrogen。PCR反應試劑盒購自東洋紡績株式會社。15～150 kDa雙色預染蛋白Marker，卡那抗生素，一步法細菌活性蛋白提取試劑盒及eIF3h抗體購自上海生工公司生物技術公司。質粒純化抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自Omega Bio-tek。其它常用試劑為實驗室自備。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊成纖維細胞總RNA的提取及eIF3h基因克隆

用Trizol法從正常的原代綿羊成纖維細胞中提取總RNA，核酸蛋白分析儀檢測其濃度及純度，0.8%瓊脂糖凝膠檢測總RNA完整性。將提取的總RNA反轉合成為cDNA，用以作為克隆綿羊eIF3h基因的模板，稀釋并保存于-20℃。(具體操作步驟參照反轉錄試劑盒說明書)

查找Genbank中預測的綿羊eIF3h基因(101115801)的參考序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，分別插入酶切位點(EcoRI、HindIII)：

上游引物F：5’-3’CCGGAATTCATGGCGTCCCGCAAGGAAG；

下游引物R：5’-3’CCCAAGCTTTTAGCTGTTGTATTCTTGAAGAGCC。

PCR擴增體系(25 μL)：ddH2O 17.25 μL、Buffer 2.5 μL、MgSO41 μL、dNTP 2.5 μL、上游引物(F)0.375 μL、下游引物(R)0.375 μL、KOD-Plus聚合酶0.5 μL、模板cDNA 0.5 μL。反應程序(35 cycles)：95℃、3 min，95℃、30s，60℃、30s，72℃、75s，72℃、10 min，4℃、30 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并使用Omega膠回收試劑盒對目的條帶進行回收，再將回收產物經過核酸蛋白分析儀檢測，以確定其濃度。

1.2.2eIF3h- pET28α(+)原核表達載體的構建

取純化確定濃度后的pET28α(+)載體及PCR回收產物，分別進行EcoRI、HindIII雙酶切，體系參照New Englang BioLabs試劑盒說明書調整：Cutsmart Buffer 2.5 μL、EcoRI限制性內切酶 0.5 μL、HindIII限制性內切酶 0.5 μL、ddH2O 18.5 μL、pET28α(+) 3 μL；Cutsmart Buffer 2.5 μL、EcoRI限制性內切酶 0.5 μL、HindIII限制性內切酶 0.5 μL、ddH2O 17 μL、膠回收產物 4.5 μL。將酶切產物再進行瓊脂糖回收純化，并用核酸蛋白分析儀檢測濃度，-20℃保存。

根據測得酶切產物計算目的片段與載體連接比例，選擇合適連接體系，用T4DNA連接酶將酶切過后的目的片段與載體連接，總體系10 μL，具體體系為：Buffer 1 μL、eIF3h酶切產物4 μL、pET28α(+)載體酶切產物 4.5 μL、T4DNA連接酶 0.5 μL，16℃連接12 h。將上述連接產物10 μL轉化至DH5α感受態細胞中，冰浴30 min，42℃水浴90s，冰浴5 min，加入1 mL無抗性LB液體培養基，輕柔混勻后37℃搖床培養1 h。取培養1 h的轉化混合物100 μL均勻涂布于含卡那抗性的固體培養基平板中，37℃倒置培養過夜。

挑取一定數量涂布后平板上的單克隆菌落，劃線于含卡那抗性的LB固體培養基平板中，37 ℃倒置培養12 h。蘸取一定量菌體，以菌體為模板進行PCR反應，初步檢測是否為構建的表達載體。篩選條帶大小正確的菌落進行培養，提取質粒，再進行EcoRI、HindIII酶切鑒定以及送樣至生物技術公司測序。

1.2.3eIE3h重組蛋白的誘導表達

將測序正確的重組質粒eIF3h-pET28α(+)轉入至E.coliBL21感受態中，具體篩選步驟同上。將BL21(eIF3h-pET28α(+))單克隆菌落接種于含抗性的液體LB培養基中，37℃培養10 h。用移液器吸取部分培養物，按照1∶100的比例重新接種于新鮮的LB液體培養基中，37℃培養至菌液OD值約為0.6時，加入IPTG(終濃度分別為0.2 mmol/L、 0.5 mmol/L、0.8 mmol/L)，誘導3.5 h。收集不同終濃度下IPTG誘導產物，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4eIE3h重組蛋白的免疫反應性分析

重組陽性菌BL21(eIF3h-pET28α(+))、pET28α(+)、BL21裂解物經SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜(冰浴條件下300 mA恒流1 h)，于37℃用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h；封閉后以4℃孵育一抗(1∶1 000稀釋，兔抗)過夜，37℃孵育二抗(1∶5 000稀釋，HPR標記抗小鼠IgG)2 h，期間每孵育完一次抗體后用TBST洗膜3次，每次10 min。配合使用相應ECL化學發光劑，曝光，顯影，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 綿羊成纖維細胞總RNA提取及eIF3h基因的擴增

將生長狀態良好的綿羊成纖維細胞提取總RNA，并反轉成cDNA，使用引物特異性擴增eIF3h基因CDS區，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小約為1 059 bp，與預期片段大小一致。圖1

M：100 bp DNA Ladder；1-2：eIF3l基因PCR產物；3陰性對照

M: 100 bp DNA Ladder; 1-2: PCR products ofeIF3hgene, 3: Negative control

圖1eIF3h基因PCR產物電泳圖
Fig.1 The agarose gel electrophoresis ofeIF3hgene

2.2eIF3h基因的生物信息學

綿羊eIF3h基因(101115801)有8個外顯子，位于綿羊9號染色體上。兩個預測轉錄本(XM_004011773.3和XM_012144735.2)，mRNA大小分別是1 226 bp和1 229 bp，相差3個堿基5’-TGA-3’，二者CDS區序列長度均為1 059 bp，共編碼352個相同氨基酸，不同在于CDS區中5’-3’中第1 011個堿基分別為T和C，起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，預測其分子式為C1754H2778N488O543S16；蛋白分子量為40 kD，等電點為6.19，在溶液中不穩定指數為45.54，高于40的域值，且在溶液中性質不穩定，脂肪系數為79.20，總平均親水指數為-0.561；對該基因信號肽、疏水性及跨膜結構的分析發現，無信號肽，無跨膜結構(TMHMM Server v.2.0)，疏水性最大值為3.22，最小值為-3.83；抗原位點具有15個，推測具有較好的免疫原性。

2.3eIE3h-pET28α(+)原核重組表達載體的構建

用EcoRI、HindIII分別雙酶切純化后的PCR產物片段及pET28α(+)質粒，酶切產物經瓊脂糖凝膠純化后，再通過連接、轉化，篩選重組子，使eIF3h基因CDS區段連接入pET28α(+)載體，并將重組載體命名為eIE3h-pET28α(+)，繪出結構示意。圖2

圖2 重組表達質粒eIE3h-pET28α(+)
Fig.2 Construction of theeIE3h-pET28α(+)expressed plasmid

注：M為marker；1～2為eIE3h- pET28α(+) 載體雙酶切；3為eIE3h-pET28α(+)；4為陰性對照

Note：M，marker；1-2：Digestion products ofeIE3h- pET28α(+) expression vector；3，eIE3h- pET28α(+) expression vector；4，Negative control

圖3eIE3h-pET28α(+)質粒酶切
Fig.3 Digestion results ofeIE3h-pET28α(+) expression vector

將重組質粒用EcoRI、HindIII進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后，得到大小約1 000～1 500 bp范圍內的片段。測序結果說明，重組質粒中插入的片段與Genbank中基因序列完全相同，原核表達載體構建成功。圖3，圖4

2.4 eIF3h重組蛋白表達形式的鑒定

篩選、鑒定出轉化至E.coliBL21的陽性菌株，接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中。37℃過夜培養，以1∶100的稀釋比例，將培養物重新接種于新培養基，培養物OD值達到0.6時，加入IPTG誘導3.5 h。分別收集誘導培養物的上清和沉淀， SDS-PAGE電泳檢測分析：外源誘導表達的重組蛋白以包涵體形式存在于沉淀(圖5、圖6分別表示誘導的重組蛋白可溶及不溶部分)，上清未檢測到重組表達的目的蛋白；在一定濃度范圍內，蛋白量隨IPTG濃度的增加而增加，與此同時蛋白量也隨著誘導時間的延長而增多。圖5，圖6

圖4eIE3h基因序列部分測序圖譜
Fig.4 The sequencing map ofeIE3h

2.5eIE3h重組蛋白的鑒定

誘導后的大腸桿菌裂解后，對該沉淀包涵體蛋白進行Western blot檢測，查看所表達的蛋白是否為目的蛋白。結果顯示：在37℃條件下，經0.8 mmol/L IPTG誘導3.5 h后收集的蛋白產物與抗體發生較明顯的免疫反應，條帶大小約為40 kD(蛋白Marker未顯示)，表明目的蛋白得到表達，該基因原核表達成功。圖7

M：蛋白marker；1：BL21未誘導；2：BL21誘導；3：BL21(pET28α(+))未誘導；4：BL21(pET28α(+))誘導；5：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))未誘導；6：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))誘導

M: Protein marker; 1, 3, 5：Without IPTG induction; 2, 4, 6:Induction with 0.8 mmol/L IPTG for BL21, BL21(pET28α(+)), BL21(eIF3h-pET28α(+)), respectively

圖5 可溶性蛋白

Fig.5 Soluble proteins

M：蛋白marker；1：BL21未誘導；2：BL21誘導；3：BL21(pET28α(+))未誘導；4：BL21(pET28α(+))誘導；5：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))未誘導；6：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))誘導

M: Protein marker; 1, 3, 5:Without IPTG induction; 2, 4, 6:Induction with 0.8 mmol/L IPTG for BL21, BL21(pET28α(+)), BL21(eIF3h-pET28α(+)), respectively

圖6 不可溶性蛋白

Fig.6 Inclusion body proteins

1： BL21未誘導；2：BL21誘導；3：BL21(pET28α(+))未誘導；4：BL21(pET28α(+))誘導；5：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))未誘導；6-8：BL21(載體eIF3h-pET28α(+))誘導

M: Protein marker; 1, 3, 5:Without IPTG induction; 2, 4, 6, 7, 8: Induction with 0.8 mmol/L IPTG for BL21, BL21(pET28α(+)), BL21(eIF3h-pET28α(+)), respectively

圖7eIE3h蛋白原核表達Western blot檢測
Fig.7 Western blot detect theeIE3hproteins inE.coliBL21

3 討 論

在研究生物體生長發育的過程中，真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)是一類在真核細胞中扮演著重要作用角色的蛋白質，參與了眾多細胞生長發育活動。eIF3是該家族成員中被廣泛研究的一類因子，在哺乳動物中其分子量約為600 kDa，由13個亞基組成其復合物，依據分子量遞減命名為eIF3a至eIF3m，分別發揮著不同的作用，eIF3h作為eIF3家族重要的亞基之一，對其作用及功能的研究也逐漸深入起來。eIF3h在正常細胞中其活性不高，主要作用是在蛋白質翻譯起始過程中參與蛋白質翻譯和對細胞周期進行調控。有研究表明，隨著eIF3h活性的增高，蛋白質的合成能力也會增加，從而影響細胞生長，促進細胞增殖[8]。

通常在原核表達過程中，常選用克隆載體進行目的片段獲取，實驗在目的片段擴增初期直接引入酶切位點，未通過克隆載體pMD18-T直接將其連接至原核表達載體pET28α(+)中，獲得了較高純度的綿羊eIF3h基因片段，并將原核表達載體轉入至大腸桿菌中，得到了大量以包涵體形式存在的目的蛋白，縮短了質粒構建周期。

在蛋白表達時，外源基因，載體及宿主三者之間的關系會影響表達的正常進行；同樣，外部條件的差異也是影響表達效率的高低的因素之一[9]，諸如誘導溫度、IPTG濃度、表達時間也能決定表達效率。實驗前期對誘導時間、溫度、菌液濃度、IPTG濃度等條件作了優化。實驗發現在培養溫度為37℃，菌液OD值為0.6時加入IPTG，使其終濃度為0.8 mmol/L，經過3.5 h的誘導即可表達出大量蛋白。通過對重組蛋白的分析，該蛋白主要以包涵體形式存在，以包涵體形式存在的蛋白可以免受蛋白水解酶的影響，可以通過離心即可收集。實驗中獲得的包涵體蛋白只需經過變、復性處理變為可溶性蛋白。

4 結 論

從綿羊成纖維細胞中克隆得到的eIF3h基因片段，經測序比對與GenBank上預測的基因序列(XM_004011773.3)相同，并將該基因片段完整定向的插入在原核表達載體pET28α(+)中，構建的eIE3h-pET28α(+)表達載體在大腸桿菌中大量表達，蛋白免疫反應檢測，eIF3h蛋白可被特異性識別，獲得的產物為目的基因表達產物，原核表達成功。通過對綿羊eIF3h基因的原核表達系統的成功實現，獲得高純度的目的蛋白，為其生物功能研究提供了數據參考。

References)

[1] [1] Dong, Z., & Zhang, J. T. (2006). Initiation factor eif3 and regulation of mrna translation, cell growth, and cancer.CriticalReviewsinOncology/hematology, 59(3):169-180.

[2] Choi, C. H., Lee, J. S., Kim, S. R., Lee, Y. Y., Kim, C. J., & Lee, J. W., et al. (2011). Direct inhibition of eif4e reduced cell growth in endometrial adenocarcinoma.JournalofCancerResearchandClinicalOncology,137(3):463-469.

[3] Zhang, L., Smit-Mcbride, Z., Pan, X., Rheinhardt, J., & Hershey, J. W. (2008). An oncogenic role for the phosphorylated h-subunit of human translation initiation factor eif3 *.JournalofBiologicalChemistry, 283(35):24,047-24,060.

[4] 吳繼華. eIF3h蛋白表達及其基因多態性與結直腸癌相關性研究[D]. 重慶:第三軍醫大學碩士論文, 2013.

WU Ji-hua. (2013).AssociationofeIF3hexpressionanditsgenepolymorphismswithcolorectalcarcinoma[D]. Master Dissertation. Third Military Medical University, Chongqing. (in Chinese)

[5] Savinainen, K. J., Linja, M. J., Saram?ki, O. R., Tammela, T. L. J., Chang, G. T. G., & Brinkmann, A. O., et al. (2004). Expression and copy number analysis of trps1, eif3s3 and myc genes in breast and prostate cancer.BritishJournalofCancer, 90(5):1,041-1,046.

[6] Savinainen, K. J., Helenius, M. A., Lehtonen, H. J., & Visakorpi, T. (2006). Overexpression of eif3s3 promotes cancer cell growth.Prostate, 66(11):1,144-1,150.

[7] Cappuzzo, F., Varellagarcia, M., Rossi, E., Gajapathy, S., Valente, M., & Drabkin, H., et al. (2009). Myc and eif3h coamplification significantly improve response and survival of non-small cell lung cancer patients (nsclc) treated with gefitinib.JournalofThoracicOncologyOfficialPublicationoftheInternationalAssociationfortheStudyofLungCancer, 4(4):472-478.

[8] Zhang, L., Smit-Mcbride, Z., Pan, X., Rheinhardt, J., & Hershey, J. W. (2008). An oncogenic role for the phosphorylated h-subunit of human translation initiation factor eif3 *.JournalofBiologicalChemistry, 283(35):24,047-24,060.

[9] 尹長城, 黃華. 大腸桿菌表達系統[M] . 北京：北京醫科大學出版社, 2002 .

YIN Chang-cheng, HUANG Hua. (2002).EscherichiaColiExpressionSystem[M]. Beijing: Beijing Medical University Press. (in Chinese)

Supported by:The National 863 Plan Project "Study on the functional genes for the wool quality character of sheep "(2013AA102506)；Xinjiang Production and Construction Crops Genetic Resources Innovation and Functional Gene Exploration & Utilization Special Project "Exploration and functional verification of the key genes for the important traits in sheep " (2012BB044)；The Xinjiang Production and Construction Corps Applied Basic Research Project "Germplasm innovation of accurate modified sheep multiplets traits gene by crispr technology"(2016AG008)

Cloning, Prokaryotic Expression and Protein Identification ofeIF3hGene from Ovis aries

YU Chang-jiang1,2, QI Cheng-nian1, ZHANG Yun-sheng2,SHEN Ming2, YANG Hua2, YANG Yong-lin2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,TarimUniversity,AralXinjiang843300，China; 2.StateKeyLaboratoryforSheepGeneticImprovementandHealthyBreeding,ShiheziXinjiang832000,China)

【Objective】 To clone gene of ovis aries eukaryotic translation initiation factor 3 subunit H and construct its prokaryotic expression vector, induce the expression and identify target protein in vitro.【Method】Firstly, the ovis aries gene ofeIF3hwould be cloned from Ovis aries cDNA library using the primers based oneIF3hsequence. The prokaryotic expression vectors were transformed into expression host strain BL21, then after, IPTG was added to induce expression. SDS-PAGE and Western blotting assays were used to detect the expression of target protein.【Result】It successfully clonedeIF3hgene sequences of CDS. The length of the CDS was 1,059 bp. The Escherichia coli containing recombinant vector expressed inclusion body proteins of 40kD after induction by IPTG at 37°C.【Conclusion】The construction of recombinant plasmid is successful, which has provided the basis for further research ofeIF3hmolecule.

ovis aries;eIF3hgene; vector construction; prokaryotic expression

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.023

2016-11-11

國家“863”計劃項目“綿羊毛品質性狀功能基因研究”(2013AA102506)；兵團種質資源創新與功能基因發掘及利用專項“綿羊重要性狀關鍵基因的挖掘及其功能驗證”(2012BB044)；新疆生產建設兵團應用基礎研究“基于CRISPR技術精確修飾綿羊多胎性狀主效基因的種質創新”(2016AG008)

于常江(1989-)，男，新疆石河子人，碩士研究生，研究方向為動物營養與飼料，遺傳育種與繁殖，(E-mail)yhmpk719@yeah.net

祁成年(1965-)，男，甘肅武威人，教授，碩士生導師，研究方向為動物營養與飼料，(E-mail)qcndky@126.com 張云生(1976-)，男，陜西漢中人，副研究員，研究方向為綿羊育種，(E-mail)xmszys@163.com

S827；S188

A

1001-4330(2017)02-0386-07