KAP16基因對細毛羊重要經濟性狀的遺傳效應分析

何軍敏，黃錫霞，田可川，趙冰茹，柏妍，田月珍，徐新明，付雪峰

(1.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊830052;2.新疆畜牧科學院畜牧研究所，分子遺傳重點實驗室，新疆烏魯木齊830011)

KAP16基因對細毛羊重要經濟性狀的遺傳效應分析

何軍敏1，2，黃錫霞1*，田可川2*，趙冰茹1，柏妍2，田月珍1，徐新明2，付雪峰2

(1.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊830052;2.新疆畜牧科學院畜牧研究所，分子遺傳重點實驗室，新疆烏魯木齊830011)

為了分析KAP16基因的遺傳多態性，獲取相關毛性狀的DNA標記，為細毛羊在分子育種上提供依據，采用重測序技術和PCR-SSCP技術，驗證KAP16候選基因的2個SNPs在中國美利奴(新疆型)群體中的遺傳多態性。同時，運用SAS 8.1軟件進行最小二乘方差分析方法，研究其與毛性狀的關聯性。結果表明，C41006938T突變點得到3種基因型為AA、AB和BB型，該群體中C41006938T突變點基因型頻率為0.22、0.47和0.31;A和B等位基因頻率為0.46和0.54，其中B等位基因為優勢等位基因。T41007938C基因位點AA和AB基因型頻率為0.77和0.23;A和B等位基因頻率分別為0.89和0.11，A基因為優勢等位基因。χ2檢驗表明，C41006938T和T41007938C位點均處于哈代溫伯格平衡狀態(P＞0.05)。C41006938T和T41007938C突變位點的多態信息含量分別為0.37和0.18，所以中國美利奴(新疆型)群體在該基因的遺傳變異處在中等水平。C41006938T不同基因型對體格大小和鑒定時體重有顯著影響(P＜0.05);T41007938C不同基因型對纖維直徑纖維直徑變異系數有極顯著影響(P＜0.01)，對剪毛量和彎曲有顯著影響(P＜0.05);C41006938T和T41007938C組合基因型對剪毛量有極顯著影響(P＜0.01)，對纖維直徑纖維直徑變異系數有顯著影響(P＜0.05)。

KAP16基因;SNPs;細毛羊;關聯性分析

我國是世界紡織業發達國家之一，尤其對羊毛加工的需求量很大，而細羊毛是主要的精紡原料，盡管其他天然纖維以及隨著工業發展涌現出的許多新型合成的纖維分享了細羊毛市場，但細羊毛因其絕緣性、吸濕性、彈性、抗靜電、抗皺性等方面的特色優勢，始終作為理想精紡加工的首選原料，占紡織原料的17%［1］。

目前，角蛋白和角蛋白相關蛋白是模式生物中主要的結構蛋白，它確定了絨毛的基本性質，如細度、長度、強度、顏色和光澤等。在毛發的形成過程中，一系列的角蛋白和角蛋白關聯蛋白還決定了毛囊細胞的分化過程［2］。一個顯著的特征是角蛋白基因按家系聚類在染色體結構中并緊密連接在一起，這種緊密的遺傳連鎖可能是共同作用調控它們表達的結果。羊毛生產性狀在品種間、品種內和不同品系間的差異明顯受到遺傳的影響［3］。本文通過分析KAP16基因的遺傳多態性和遺傳效應，旨在獲取相關毛性狀的DNA標記，為細毛羊的育種在分子育種學上提供理論依據。為細毛羊的育種在分子育種學上提供理論依據。馮靜、艾買提和瑪依拉等人分別研究了綿羊KAP基因和KRT基因多態性與毛性狀的相關性［4－8］，趙志東、于輝和趙苗等對KAP基因遺傳變異與基因性狀及其對羊絨性狀的影響都有深入研究［9－11］。獲取與綿羊相關毛性狀的DNA分子標記，并為細毛羊的育種在分子育種學上提供理論依據。羊毛纖維具有高度組織結構，其中毛纖維的90%是由角蛋白中間絲(KRT-RF)和角蛋白關聯蛋白(KAPs)構成，這兩種蛋白類型通過高度組織分化的方式形成規則的晶狀結構，其中KIF蛋白形成纖維絲鑲嵌在KAP蛋白基質中，這種規則的晶狀結構需要高度協調的遺傳調控，然而，這種調控機理還不完全清楚。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為新疆鞏乃斯種羊場提供的中國美利奴羊(新疆型)，采取416只周歲母羊的毛樣與血樣。其中鑒定時體重、毛彎曲評分、油汗、體格大小、剪毛后體重、剪毛量等數據由新疆鞏乃斯種羊場提供。毛樣在羊毛分析實驗室檢測羊毛的纖維直徑、纖維直徑變異系數、毛長、細度、彎曲和彎曲數，通過整理共得到832條有效數據。靜脈采血3～5 mL，用EDTA抗凝并冷凍保存備用，用于提取DNA，并篩選有羊毛性狀鑒定記錄的個體樣本進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 重測序技術及引物的合成取所測纖維細度數值中的兩端極值各15個樣本，建立2個DNA池(粗池和細池)，由諾禾致源生物公司運用Illunima HiSeqTM2000/MiseqTM軟件進行質控分析。引物來自NCBI提供的綿羊基因序列并結合重測序結果，采用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1。

1.2.2 PCR擴增程序的設定見表2。

1.2.3 PCR產物測序經過普通PCR擴增和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測將合格的PCR產物送到上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 數據統計與分析

對數據進行χ2獨立性檢驗，多態信息含量(PIC)，遺傳純合度(Ho)，雜合度(He)和有效等位基因數(Ne)的計算

1.4 關聯分析模型

通過整理共得到有效數據832條，并對毛性狀進行遺傳效應分析。運用SAS 8.1統計軟件檢測不同基因型與毛性狀的關聯性，并估計最小二乘均值。最小二乘方差分析數學模型:Yijk=u+αi+βj+eijk，式中，Yijk:個體表型記錄;μ:群體性狀均值;αi:標記基因型效應或標記組合基因型效應;βj:群別效應，eijk:隨機誤差。

表1 PCR擴增的引物序列Table 1 PCR amplification primer sequence

表2 PCR擴增條件Table 2 PCR amplification conditions

表3 KAP16的重測序結果Table 3 KAP16 sequencing result

圖1 DNA的結果Fig.1 Results of DNA

圖2 P1的PCR產物Fig.2 PCR products of P1

圖3 P2的PCR產物Fig.3 PCR products of P2

2 結果與分析

2.1 KAP16的重測序結果

由表3可知，KAP16基因的C41006938T和T41007938C突變位點分別位于11號染色體的第5和4外顯子上。

2.2 DNA完整性檢測結果

圖4 P1的SSCP產物Fig.4 SSCP products of P1

圖5 P2的SSCP產物Fig.5 SSCP products of P2

提取基因組DNA模板用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，實驗提取的基因組DNA模板質量良好、純度高、不需要純化，可直接用作模板DNA。

2.3 KAP16基因的PCR擴增結果

如圖2～3所示，PCR產物經2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可知KAP16基因P1、P2引物的PCR產物長度為216、196 bp與生物公司提供片段符合。結果表明，KAP16擴增特異性良好，片段長度一致，引物的片段長度符合預期大小，可直接用于PCRSSCP的分析。

2.4 KAP16基因的PCR-SSCP多態性檢測結果

如圖4～5所示，P1位點存在3種不同的帶型，將其命名為AA、BB和AB型;P2位點存在，2種基因型，命名為AA、AB型。

2.5 KAP16基因位點多序列比

圖6 P1突變點不同基因型測序峰圖Fig.6 P1 mutation point of different genotype sequencing peak figure

圖7 P2突變點不同基因型測序峰圖Fig.7 P2 mutation point of different genotype sequencing peak figure

2.5.1 P1位點多序列比對比由圖6可知，在中國美利奴羊(新疆型)群體中發現此序列在第5外顯子編碼區第31 bp發生突變。通過對氨基酸序列的分析發現，其C31T突變點為非同義突變，由Arg (精氨酸)突變為Trp(色氨酸)。

2.5.2 P2位點多序列比對結果及峰圖由圖7可知，在中國美利奴羊(新疆型)群體中發現該序列在第四外顯子處存在編碼區第38 bp發生了突變。突變位點為T38C，通過對氨基酸序列的分析發現，其突變點由Val(纈氨酸)突變為Ala(丙氨酸)。

2.6 KAP16的遺傳多態性分析

由表4可知，該群體中C41006938T突變點的AB基因型為優勢基因型，B基因是優勢等位基因; T41007938C基因的AA基因型是優勢基因型，A基因是優勢等位基因。卡方檢驗表明，C41006938T和T41007938C位點均處Hardy-Weinberg平衡狀態(P＞0.05)。中國美利奴(新疆型)群體中C41006938T和T41007938C突變點的PIC為0.37，0.18均屬于中度多態，因此中國美利奴(新疆型)群體的遺傳變異居于中等水平。

表4 基因頻率和基因型頻率的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗Table 4 Distribution of gene frequency and genotype frequency and Hardy-Weinberg equilibrium card square test

表5 C41006938T和T41007938C基因型和群別對毛性狀的影響Table 5 The effect of C41006938T and T41007938C genotype and group on wool traits

表6 C41006938T和T41007938C不同基因型與毛性狀間的關系Table 6 C41006938T and T41007938C relationship between different genotypes and wool traits

2.7 KAP16基因位點與羊毛性狀的關聯性分析

2.7.1 KAP16基因位點不同基因型的最小二乘方差分析由表5可知，C41006938T不同基因型對體格大小和鑒定時體重有顯著影響(P＜0.05)。群別對鑒定時體重、纖維細度、體格大小和纖維直徑有極顯著影響(P＜0.01)。T41007938C不同基因型對中國美利奴(新疆型)的纖維直徑變異系數有極顯著影響(P＜0.01);對剪毛量和彎曲有顯著影響(P＜0.05);不同群別對中國美利奴(新疆型)鑒定是體重、纖維細度、體格大小和纖維直徑有極顯著影響(P＜0.01)。

2.7.2 KAP16基因位點不同基因型與毛性狀的關聯性分析由表6可見，C41006938T位點BB基因型對AA和AB基因型鑒定時體重和體格大小差異顯著(P＜0.05);T41007938C位點AB基因型對AA基因型纖維直徑變異系數差異極顯著(P＜0.01)，對剪毛量和彎曲差異顯著(P＜0.05)。

2.8 KAP16基因位點不同基因型組合效應與羊毛性狀的關聯性

2.8.1 KAP16不同基因型組合效應最小二乘方差分析由表7可知，C41006938T和T41007938C對剪毛量有極顯著影響(P＜0.01);對纖維直徑變異系數有顯著影響(P＜0.05);不同群別對鑒定時體重、纖維細度、體格大小、剪毛后體重、纖維直徑有極顯著影響(P＜0.01)。

2.8.2 KAP16不同基因型組合效應由表8可知，KAP16組合基因AABB型對剪毛量差異極顯著(P＜0.01);AABB基因型、ABAA基因型和ABBB基因型對纖維直徑變異系數差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

3.1 KAP基因的多態性分析

Mclaren等［12］通過連鎖分析已經將KAP1.1、KAP1.2、KAP1.3、KAP3.2定位到綿羊的21號染色體上。研究人員針對KAP基因家族的多態性做了許多研究，Parsons等［13］以KRTAP6和KRTAP8為候選基因，證實這兩個基因位點和羊毛產量及纖維直徑存在明顯的相關性，推測在KAP6和KAP8同一區域可能存在控制羊毛直徑的主基因。Henry等［14］利用超細的美利奴羊和羅姆尼羊的回交群體，測定了包括周歲體重、羊毛產量、平均纖維直徑在內的多個性狀，同時用216個微衛星標記進行了基因組掃描，找到了一個與羊毛纖維直徑相關的位點。Itenge-Mweza［15］在澳洲美利奴羊中報道KAP1.3 (B2C)基因存在9個獨特的SSCP帶型，序列分析顯示這9個帶型代表8個新的KAP1.3等位基因，在KAP1.3基因c.240G＞A突變位點的3種基因型分別為GG、AA和AG，在KAP1.3基因c.312G＞A突變位點的GG、AA和AG等3種基因型。KRT和KAP多態性位點可能導致基因部分改變的從而導致羊毛特征的變化，這些識別標記可用于在羊毛產業的基因分子標記輔助選擇。劉桂芬［16］選擇21號染色體上高硫蛋白家族中KAP1.1、KAP1.3中的部分序列和1號染色體高甘氨酸-酪氨酸蛋白KAP6.1的外顯子進行研究，結果發現KAP1.1、KAP1.3所在區域中位點W08667與羊毛細度顯著相關。張亞妮［17］應用PCR-SSCP技術分析了內蒙古白絨山羊和遼寧絨山羊KAP基因與經濟性狀的關系，KAP1.3基因S4位點AB基因型與遼寧絨山羊產絨量相關，KAP1.3基因S3位點AA基因型與內蒙古白絨山羊體重相關，KAP1.3基因S2位點BB基因型與遼寧絨山羊體重相關。馮靜等［3］應用PCR-RFLP方法分析綿羊KAP1.3基因遺傳多態性，結果表明KAP1.3基因存在2個SNP位點。王春昕［18］應用PCR-SSCP技術對羊毛纖維組成蛋白中的KAP1.3基因部分序列進行多態性分析，結果表明KAP1.3基因與產毛量和拉伸長度相關。

表7 C41006938T和T41007938C不同組合基因型對毛性狀的影響Table 7 Effect of C41006938T and T41007938C different combination genotype on wool traits

表8 KAP16不同組合基因型與毛性狀間的關系Table 8 KAP16 and different combination of relationship between genotype and wool traits

3.2 國內外對綿羊KAP基因家族的相關研究

目前，該領域的研究熱點之一是關于羊毛細度決定位點或相關基因的研究Mclaren等［12］通過連鎖分析已經將角蛋白輔助蛋白KAP6.1，KAP7和KAP8定位到綿羊的第1號染色體上。Ponz等［19］通過片段定位方法尋找控制羊毛性狀的QTL，利用法國的合成品系INR401對40個微衛星標記進行了分析，結果發現了在3號、7號、25號染色體上有控制毛長(SL)的QTL，在6號染色體上有控制毛纖維直徑(WFD)的QTL，在7號染色體上有控制毛纖維直徑纖維直徑變異系數的QTL。Cockett N E［20］認為KAP6.n和羊毛直徑有關。Chen等［21］研究表明KAP8.1和KAP1.3基因表達模式相似，在羊皮膚中KAP1.3高度表達，KAP8.1表達較弱。此外，KAP8.1和KAP1.3的位點多態性與纖維直徑差異顯著。KAP8.1中BC基因型對纖維直徑有極顯著的影響，KAP1.3中AA基因型對纖維直徑有極顯著的影響。此外，KAP8.1與KAP1.3基因的最優組合基因型為BC-AA組合基因型。

3.3 KAP16基因與中國美利奴羊(新疆型)毛性狀的關連分析

羊毛性狀是細毛羊重要的經濟性狀之一，分子標記成為研究重要表型的方法之一，并被廣泛用于動物的遺傳研究中。KAP16基因通過全基因組測序攻擊獲得8個SNPs突變位點，本文研究了其中的兩個突變點對中國美利奴(新疆型)的遺傳效應分析，將繼續研究其他位點對中國美利奴(新疆型)的遺傳效應。

C41006938T不同基因型對體格大小和鑒定時體重有顯著影響。群別對鑒定時體重、纖維細度、體格大小和纖維直徑有極顯著影響。C41006938T基因位點對鑒定時體重和體格大小差異顯著; T41007938C不同基因型對中國美利奴(新疆型)的纖維直徑變異系數有極顯著影響;對剪毛量和彎曲有顯著影響;不同群別對中國美利奴(新疆型)鑒定是體重、纖維細度、體格大小和纖維直徑有極顯著影響。T41007938C基因型對中國美利奴羊(新疆型)纖維直徑變異系數差異極顯著;對剪毛量和彎曲差異顯著。C41006938T和T41007938C對剪毛量有極顯著影響;對纖維直徑變異系數有顯著影響;不同群別對鑒定時體重、纖維細度、體格大小、剪毛后體重、纖維直徑有極顯著影響。KAP16組合基因型對中國美利奴(新疆型)剪毛量差異極顯著;對纖維直徑變異系數差異顯著。

在所研究的綿羊群體中，KAP16基因的2個突變位點均呈現出中度多態性，說明在這些位點處中國美利奴(新疆型)群體遺傳變異處于中等水平，變異程度相似，沒有太大的差異，同時也說明在上述各群體的培育改良中可以加強人工選擇的強度。

4 結論

本試驗首次通過重測序技術，發現KAP16基因在染色體11上第4外顯子SNP突變點為T41007938C，第5外顯子SNP突變點為C41006938T。通過分析可知，C41006938T不同基因型對體格大小和鑒定時體重有顯著影響; T41007938C不同基因型對纖維直徑纖維直徑變異系數有極顯著影響，對剪毛量和彎曲有顯著影響; C41006938T和T41007938C組合基因型對剪毛量有極顯著影響，對纖維直徑纖維直徑變異系數有顯著影響。

［1］田月珍.中國美利奴羊(新疆型)母羊羊毛細度相關候選基因的篩選及其關聯性分析［D］.烏魯木齊:新疆農業大學，2012.

［2］汪玲.KAP7.1、KAP8.2基因在遼寧新品系絨山羊興盛期毛囊中的表達及分析［D］.大連:遼寧師范大學，2010.

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［4］馮靜，楊華，宋天增，等.綿羊KAP1.1基因克隆與單核苷酸多態性分析［J］.西南農業學報，2010，23(5):1720－1724.

［5］馮靜，宋天增，楊華，等.綿羊KAP6.1基因的遺傳多態性分析［J］.西南農業學報，2012，25(1):276－278.

［6］瑪依拉.6個KRT基因的遺傳多態性及其與中國美利奴羊(新疆型)毛性狀的關聯性分析［D］.烏魯木齊:新疆農業大學，2013.

［7］艾買提.5個KAP基因在中國美利奴羊(新疆型)的多態性及其與毛性的關聯性分析［D］.烏魯木齊:新疆農業大學，2013.

［8］Cheng C T，Kuo C Y，David K A.KAPtain in charge ofmultiplemissions:Emerging rolesof KAP1［J］.World Journal of Biological Chemistry，2014，8.26，5(3):308－320.

［9］趙志東.KAP9.2基因的群體遺傳變異及羊絨生長期和休止期基因的表達研究［D］.咸陽:西北農林科技大學，2012.

［10］于輝.絨山羊KAP基因家族與Hoxc13基因遺傳變異及其對產絨性狀的影響［D］.咸陽:西北農林科技大學，2009.

［11］趙苗.絨山羊6個候選基因遺傳變異及其與經濟性狀關系研究［D］.咸陽:西北農林科技大學，2008.

［12］Mclaren R J，Rogers G R，Davies K P，et al.Linkage mapping of wool keratin and keratin-associated protein genes in sheep［J］.Mammali-an Genome，1997(8):938－940.

［13］Parsons Y M，Cooper DW，Piper L R.Evidence of linkage between high-glycine-tyrosine keratin gene loci and wool fibre diameter in a merino half-sib family［J］.Anim Genet，1994，25:105－108.

［14］Henry H M.A genome screen for QTL forwool traits in a Merino X Romney backcross flock［J］.Mammalian Genome，1998(8):938－940.

［15］Itenge M，Weza TQ，ForrestR H，etal.Polymorphism of the KAP1.1，KAP1.3 and K33 genes in Merino sheep［J］.Mol Cell Probes，2007，21(5－6):338－342.

［16］劉桂芬.新疆優質細毛羊遺傳多樣性及羊毛細度候選基因的分析［D］.烏魯木齊:新疆農業大學，2005.

［17］張亞妮.兩個絨山羊品種微衛星多態性與產絨性能的分子標記研究［D］.咸陽:西北農林科技大學，2005.

［18］王春昕，張金新，金海國，等.KAP1.3基因與綿羊產毛性能的相關分析［J］.吉林畜牧獸醫，2009，30(4):5－6.

［19］Ponz R，Moreno C，Daniel A，et al.Assessment of genetic variation explained bymarkers for wool traits in sheep via a segmentmapping approach［J］.Mammalian Genome，2001，12:569－572.

［20］Cockett N E.Analysis of the sheep genome［J］.Physiol Genomics，2001(7):69－81.

［21］Chen H Y，Zeng X C，HuiW Q，et al.Developmental expression patterns and association analysisof sheep KAP8.1 and KAP1.3 genes in Chinese Merino sheep［J］.Indian Journal of Animal Sciences，2011，81(4):391－96.

(責任編輯 李潔)

Analysis of Genetic Effects of KAP16 Gene w ith M ain Econom ic Traits in Fine W ool Sheep

HE Jun-min1，HUANG Xi-xia1*，TIAN Ke-chuan2*，ZHAO Bing-ru1，BAIYan2，TIAN Yue-zhen1，XU Xin-ming2，FU Xue-feng2
(1.Animal Science of Xinjiang Agricultural University，Xinjiang Urumqi 830052，China;2.Xinjiang Academy of Animal Husbandry and Animal Husbandry Institute Laboratory of Molecular Genetics，Xinjiang Urumqi830011，China)

The genetics of KAP16 genewas analyzed to find out the polymorphisms and obtain DNA markers that associated with wool traits，to providemolecular bases formolecular breeding on fine wool sheep.In the research，re-sequencing and PCR-SSCPmethodswere used to analyze the genetic variations of2 SNPsmutation points in KAP16 gene and genetic polymorphism in Chinese Merino(Xinjiang type)population.At the same time，the SAS 8.1 least-squares analysis technique was used to study correlation with wool traits.The results showed that，C41006938Tmutation pointswere observed(named as AA，AB and BB，respectively)，the frequency of genotypeswere0.22，0.47 and 0.31，respectively;correspondingly，frequenciesofallele A and Bwere0.46 and 0.54，among them，B allelewas dominantallele.The frequency of genotypes of AA and AB at T41007938Cmutation pointswere0.77 and 0.23，respectively;frequenciesof allele A and Bwere 0.89 and 0.11，A allelewas dominantallele.χ2 test raveled that the C41006938T and T41007938C pointwere in the Hardy-Weinberg disequilibrium(P＞0.05).The polymorphic information content of C41006938T and T41007938C gene points were 0.37 and 0.18;therefore，Chinese Merino(Xinjiang type)population was reached themoderate level in genetic variation of the gene.Different genotypes on the physical size and identification has obvious effect on body weight(P＜0.05)on C41006938T;different genotype has a significant effect on fiber diameter variation coefficient(P＜0.01)on T41007938C，There is a significant quantity of shearing and bending effect(P＜0.05);C41006938T and T41007938C combination genotype has a significant effect on shearing quantity(P＜0.01)and fiber diameter variation coefficient(P＜0.05).

KAP16 gene;SNPs;Fine wool sheep;Correlation analysis

S814.8

A

1001－4829(2017)2－0458－08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.036

2016－04－07

國家自然科學基金(31360543，31460593);農業部體系項目(CARS-40);新疆農業大學產學研聯合培養研究生示范基地項目(xjaucxy-yjs-20152011)

何軍敏(1991－)，女，新疆烏蘇人，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種的研究，E-mail:1415230131@qq.com，Tel: 15299126423，*為通訊作者:黃錫霞(1963－)，教授，研究方向為動物遺傳育種，E-mail:au-huangxixia@163.com，田可川(1963－)，研究員，研究方向為動物遺傳育種，E-mail:tiankechuan@ 163.com。