家蠶不同齡期感染菜粉蝶微孢子蟲的差異性分析

陳世良，肖圣燕，楊榮貴，高建華，高翔，朱峰，張永紅，廖鵬飛

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101)

家蠶不同齡期感染菜粉蝶微孢子蟲的差異性分析

陳世良，肖圣燕，楊榮貴，高建華，高翔，朱峰，張永紅，廖鵬飛*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101)

為分析菜粉蝶微孢子蟲對家蠶不同齡期的感染力差異，利用在云南省蒙自市收集的菜粉蝶，對其體內(nèi)的微孢子蟲進(jìn)行分離、純化與鑒定。通過葉面添食的方法，先后將菜粉蝶微孢子蟲(約1.21×108粒)分別添給2、3、4、5齡起蠶各160頭食用，隨后正常飼養(yǎng)至上蔟結(jié)繭、化蛹、羽化。檢驗(yàn)死蠶、不結(jié)繭蠶、死籠繭及蛾子中菜粉蝶微孢子蟲的感染情況。綜合統(tǒng)計(jì)分析菜粉蝶微孢子蟲對各齡期家蠶的危害性和感染的差異性。結(jié)果表明:菜粉蝶微孢子蟲對家蠶不同齡期的感染力存在顯著性差異，隨著家蠶齡期的增加，菜粉蝶微孢子蟲的感染力逐漸降低。

家蠶;菜粉蝶微孢子蟲;感染;研究

家蠶屬鱗翅目家養(yǎng)經(jīng)濟(jì)昆蟲，野外患微粒子病的昆蟲是家蠶微粒子病的重要來源，尤其是菜粉蝶，它作為十字花科作物的主要害蟲，具有蟲口基數(shù)大、分布范圍廣、蟲體微孢子蟲檢出率高的特點(diǎn)。患微粒子病菜粉蝶與家蠶之間存在緊密的交叉感染關(guān)系，因此，對菜粉蝶微孢子蟲的致病性進(jìn)行研究，具有一定的代表性和實(shí)用性。國內(nèi)的科技工作者對菜粉蝶微孢子蟲的形態(tài)特征及對家蠶的病原性也曾開展了大量的工作［1－6］，但對家蠶不同齡期的感染率差異未見報(bào)道。筆者從野外菜粉蝶(菜青蟲的成蟲)體內(nèi)分離到一種微孢子蟲，文章利用該菜粉蝶微孢子蟲對家蠶各齡期進(jìn)行添食試驗(yàn)研究，以了解菜粉蝶微孢子蟲對家蠶各齡期的危害性和感染的差異性。這將有助于蠶種生產(chǎn)者認(rèn)識家蠶病原性微孢子蟲，為防止野外昆蟲對家蠶的交叉感染與各級蠶種檢疫、生產(chǎn)提供防治依據(jù)和安全保障。

1 材料與方法

1.1 供試蠶品種

經(jīng)母蛾檢驗(yàn)無微粒子病的家蠶原種“青松”，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供。

1.2 菜粉蝶微孢子蟲的收集

于2015年2月在云南蒙自地區(qū)捕捉到的野外菜粉蝶，通過研磨，點(diǎn)板鏡檢，確定患微粒子病的菜粉蝶，將其收集后經(jīng)過濾、離心等工序?qū)w內(nèi)的微孢子蟲進(jìn)行分離、提純、保存于4℃下待用。

1.3 菜粉蝶微孢子蟲的分子生物學(xué)鑒定

參照堿發(fā)芽抽提法(TEK法)［7］，進(jìn)行基因組的提取。利用正向引物18f:CACCAGGTTGATTCTGCC與反向引物1537r:TTATGATCCTGCTAATGGTTC進(jìn)行該微孢子蟲核糖體小亞基基因(SSU rRNA)的克隆與測序。將測序獲得的結(jié)果進(jìn)行BlAST分析并下載相似序列，隨后用ClustalX1.83軟件對所獲得的菜粉蝶微孢子蟲序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對分析。用MEGA 5.0軟件的鄰位相連法(neighbor joining，NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹作圖，選用鰻魚微孢子蟲(Heterosporis anguillarum)作為外群，進(jìn)行1000次bootstrap校正。

1.4 感染率調(diào)查

先進(jìn)行添食微孢子蟲樣液的配制，使各齡起蠶添食菜粉蝶微孢子蟲數(shù)目大致相同，約為1.21× 108粒(濃度為6.06×107粒/mL的孢子液2 mL)。

將家蠶原種“青松”催青孵化后收蟻蠶1 g進(jìn)行飼養(yǎng)，至2齡餉食時(shí)，把蠶分為5個(gè)組，每組約160頭。分別為2、3、4、5齡餉食時(shí)添食及不添食的對照。添食是一次性的，將添食樣液用排筆均勻涂抹在桑葉上，待稍涼干后給原蠶食用，待添食桑葉吃完后按常規(guī)條件進(jìn)行飼養(yǎng)，飼喂的桑葉進(jìn)行全程清洗，以確保飼育過程中桑葉不被微孢子蟲污染。

各處理家蠶添食后，及時(shí)觀察并鏡檢各區(qū)病死蠶感染菜粉蝶微孢子蟲情況。上蔟結(jié)繭后第7天削繭并進(jìn)行蠶蛹性別區(qū)分，將雌雄蛹分開放置。對不結(jié)繭蠶、死籠繭中的病死個(gè)體進(jìn)行鏡檢，確定其感染菜粉蝶微孢子蟲的情況。各處理化蛾后在自然溫度下放4 d后再烘烤和鏡檢，觀察記載各處理蠶蛾感染菜粉蝶微孢子蟲的情況，計(jì)算綜合感染的結(jié)果，并用方差分析不同齡期家蠶添食菜粉蝶微孢子蟲感染后對蛾子產(chǎn)生的影響及其雌雄蛾之間的差異性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

對試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)采用EXCEL 2003數(shù)據(jù)處理軟件和“組內(nèi)只有單個(gè)觀察值的兩向分組資料的方差分析”的方法［8］，對4個(gè)齡期感染菜粉蝶微孢子蟲的情況進(jìn)行方差分析，在存在顯著性差異的前提下，應(yīng)用LSR法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜粉蝶微孢子蟲的分子鑒定

該菜粉蝶微孢子蟲(Nosema sp.Mpr-Yunnan)核糖體小亞基基因(SSU rRNA)長1245 bp，序列比對分析發(fā)現(xiàn)其與Chen等［9］報(bào)道的菜粉蝶微孢子蟲(Nosema sp.Mpr)SSU rRNA基因序列相似性為100 %。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果(圖1)顯示從云南地區(qū)分離到的菜粉蝶微孢子蟲與Nosema sp.Mpr處于同一進(jìn)化分支，表明它們很可能是同一物種，至少具有非常近的親緣關(guān)系。因此，暫定名為Nosema sp.Mpr-Yunnan。

圖1 用鄰位相連法構(gòu)建的菜粉蝶微孢子蟲核糖體小亞基基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of SSU rRNA gene sequence of Nosema sp.Mpr-Yunnan constructed by the neighbor joiningmethod

2.2 對各齡試驗(yàn)組病死蠶、不結(jié)繭蠶、死籠繭微孢子蟲的檢驗(yàn)

從表1看出，2、3齡期添食菜粉蝶微孢子蟲感染的家蠶在幼蟲期有死蠶現(xiàn)象發(fā)生，4齡期5齡期添食感染的家蠶在幼蟲期則沒有發(fā)生死蠶，都能正常上蔟結(jié)繭。幼蟲期只有2齡試驗(yàn)組有1頭死亡的家蠶感染了菜粉蝶微孢子蟲，但3齡試驗(yàn)組在不結(jié)繭蠶和死籠繭中、4齡試驗(yàn)組在死籠繭中可檢驗(yàn)到部分感染了微孢子蟲的死亡個(gè)體，而5齡試驗(yàn)組和對照組則沒有因微孢子蟲的感染而死亡的幼蟲。說明添食感染時(shí)間越早，不結(jié)繭蠶、死籠繭增多，相應(yīng)感染了菜粉蝶微孢子蟲的頭數(shù)也隨之增多。總之，隨著添食齡期的增加，死亡的個(gè)體中微孢子蟲感染率逐漸升高，2齡試驗(yàn)組感染率高達(dá)85.1%，3齡4齡試驗(yàn)組感染率逐漸下降，5齡試驗(yàn)組感染率則為零。

2.3 對各試驗(yàn)組家蠶雌雄蛾感染菜粉蝶微孢子蟲的檢驗(yàn)

從表2看出，各處理裝袋家蠶雌雄蠶蛾各50頭，分別檢驗(yàn)100頭，同一試驗(yàn)組雌雄蛾感染菜粉蝶微孢子蟲數(shù)量差異不明顯。5齡試驗(yàn)組感染率雌雄平均只有33%，2齡試驗(yàn)組蠶蛾的平均感染率高達(dá)100%，全部蠶蛾被菜粉蝶微孢子蟲感染。即添食齡期越小，感染率越高，蠶蛾體內(nèi)菜粉蝶微孢子蟲數(shù)目越大，每視野中看到的微孢子蟲數(shù)量越多。

2.4 各試驗(yàn)組家蠶感染菜粉蝶微孢子蟲檢驗(yàn)綜合情況結(jié)果

各試驗(yàn)組家蠶感染菜粉蝶微孢子檢驗(yàn)綜合結(jié)果如圖1所示，綜合感染率隨著齡期的增加而下降，由2齡試驗(yàn)組的95.24%逐漸下降至5齡試驗(yàn)組的28.95%，對照為0。

表1 各齡試驗(yàn)組病死蠶、不結(jié)繭蠶、死籠繭中感染微孢子蟲的情況Table 1 The infection situation of dead silkworms，non-spinning silkworms and dead worm in cocoon bymicrosporidia

表2 各試驗(yàn)組家蠶雌雄蛾感染菜粉蝶微孢子蟲的情況Table2 The infection situation of female silkworm moths and male silkworm moths bymicrosporida

2.5 方差分析雌雄蛾之間、各齡期之間感染菜粉蝶微孢子蟲的差異性

由表3所得，齡期間F=85，大于v1=3，v2=3的F0.01=29.46，推斷各齡期間有極顯著差異，需進(jìn)一步做差異顯著性比較。而雌雄蛾間F=0.35＜1，即F值小于v1=1，v2=3的F0.05=10.13，推斷雌雄間無顯著差異，不需作多重比較。齡期間比較分析如下:SE=1.68，按v=3，查表得p=2，3，4，5時(shí)的SSR0.05和SSR0.01值，并按LSRa=SE×SSRa計(jì)算可得到P時(shí)的LSR0.05和LSR0.01的值見表4。4個(gè)齡期間添食后蛾子感染的差異顯著性見表5。

圖1 各試驗(yàn)組家蠶感染菜粉蝶微孢子蟲綜合情況Fig.1 Comprehensive situation of silkworms infected bymicrosporidia from every experimental group

通過家蠶4個(gè)齡期的添食試驗(yàn)，比較感染蛾子的差別，2齡與3齡間無顯著差異，2齡、3齡與4齡、5齡間感染差異達(dá)1%極顯著水平，4齡與5齡間感染差異達(dá)1%極顯著水平。

3 討論

根據(jù)試驗(yàn)分析，幼蟲期死亡的，除2齡、3齡試驗(yàn)組均有外(因菜粉蝶微孢子蟲感染而死亡的概率極低)，4齡、5齡試驗(yàn)組和對照組則沒有死亡的個(gè)體。添食時(shí)間越早，不結(jié)繭蠶、死籠繭會越多，感染菜粉蝶微孢子蟲的頭數(shù)也越多，2齡試驗(yàn)組的感染率高達(dá)85.1%，隨著齡期增加，死亡個(gè)體中感染菜粉蝶微孢子蟲的概率逐漸下降，5齡試驗(yàn)組的菜粉蝶微孢子蟲檢出率為零。通過鏡檢蠶蛾，發(fā)現(xiàn)各試驗(yàn)組菜粉蝶微孢子蟲的感染率隨著齡期的增加而下降，2齡試驗(yàn)組雌雄蠶蛾平均感染率高達(dá)100%，而5齡試驗(yàn)組雌雄蠶蛾的平均感染率為33%。綜合看，2齡試驗(yàn)組感染率為95.24%，3齡試驗(yàn)組感染率為82.46%，四齡試驗(yàn)組感染率為51.38%，5齡試驗(yàn)組感染率為28.95%，對照則無感染。添食越早，感染率越高，每鏡檢視野中微孢子數(shù)量越多，相互污染的機(jī)會也越多，給蠶種生產(chǎn)和檢疫工作帶來的不利因素也越大。方差分析認(rèn)為，菜粉蝶微孢子蟲給家蠶添食后對雌雄蠶蛾的感染率沒有差異性，而添食后對家蠶各齡期之間的感染率除2齡與3齡間無顯著差異外，其余各齡期間都有顯著差異。

表3 各齡期蛾子之間、雌蛾雄蛾之間感染菜粉蝶微孢子蟲的差異性方差分析Table 3 Variance analysis of themoths of different instar，female and malemoths infected bymicrosporidia

表4 各齡期的LSR值Table 4 The LSR values of different instar

表5 各齡期蛾子感染菜粉蝶微孢子蟲的顯著差異性分析Table 5 Analysis of the difference significance for themoths of different instar larvae infected bymicrosporidia

通過試驗(yàn)，基本明確了菜粉蝶微孢子蟲對家蠶的感染性和致病性。如果在蠶的幼蟲階段食下菜粉蝶微孢子蟲，家蠶能正常生長、發(fā)育，完成其生活世代［9］。添食相同數(shù)量的菜粉蝶微孢子蟲，蠶齡期越小，蠶體對菜粉蝶微孢子蟲感染的抵抗力越弱，感染率越高，蠶齡期越大，蠶體對菜粉蝶微孢子蟲感染的抵抗力越強(qiáng)，感染率下降。家蠶感染菜粉蝶微孢子蟲的時(shí)期早與遲，對絲繭育的產(chǎn)繭量影響不大，但對種繭育影響很大，這給各級蠶種生產(chǎn)對母蛾檢驗(yàn)中的微孢子蟲鑒別帶來了難度［10］，給病害管理及蠶種檢驗(yàn)后的合格判定帶來了困難，母蛾微粒子病的檢出率上升，就會增加蠶種淘汰的風(fēng)險(xiǎn)率［11］。因此，在蠶種繁育過程中，各種繭育的生產(chǎn)基地，要避免野外昆蟲的交叉感染，尤其要阻止以菜粉蝶為代表的微孢子蟲對家蠶的危害。

［1］萬水繼.從種繭養(yǎng)蠶分離的具有形態(tài)差異的N，bombycis類微孢子蟲的研究［J］.四川蠶業(yè)，1988(3):11－13.

［2］鄭祥明，楊瓊，方定堅(jiān)，等.廣東省昆蟲微孢子蟲資源調(diào)查及交叉感染的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2003，29(4):380－383.

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Difference Analysis of Silkworm Larvae w ith Different Instars Infected by M icrosporidia Isolated from Pieris rapae L.

CHEN Shi-liang，XIAO Sheng-yan，YANG Rong-gui，GAO Jian-hua，GAO Xiang，ZHU Feng，ZHANG Yong-hong，LIAO Peng-fei*
(Institute of Sericulture and Apiculture，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Mengzi661101，China)

In order to explore the diversity of infectivity of the silkworm larvaewith different instars infected by themicrosporidia isolated from Pieris rapae L，the cabbage butterfly were collected from Mengzi，Yunnan province.Themicrosporidian spores were isolated from the cabbage butterfly，purified and identified.The second，third，fourth，and fifth instar silkworm larvae(160 larvae/group)were respectively fed with themulberry leaveswhich was treated with themicrosporidian spores(approximately 1.21×108spores).Then the silkwormswere normally fed with the clean mulberry leaves until to cocooning，pupating and eclosion.The infection situation of dead silkworms，non-spinning silkworms，dead worm in cocoon and silkworm moth was researched.The diversity of infectivity of the silkworm larvae with different instars infected by themicrosporidiawas analyzed according to the statistical results.The results indicated that therewas significant difference of the infection rate among the silkworm larvae with different instars infected by microsporidia isolated from Pieris rapae L.The infection rate of silkworm infected bymicrosporidia was gradually decreased with the increase of age.

Silkworm larvae with different instars;Microsporidia isolated from Pieris rapae L.;Infection;Research

S884.72

A

1001－4829(2017)2－0481－04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.040

2016－04－15

陳世良(1964－)，男，云南陸良人，本科，副研究員，主要從事蠶種質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫研究工作，E-mail:chenshl123 @163.com，*為通訊作者，E-mail:liaolpf@126.com。