重組葡萄糖脫氫酶的表達及輔酶再生應用研究

李凌凌,劉曜寧,呂早生,楊忠華,左振宇,宋采薇

(武漢科技大學化學與化工學院,湖北 武漢,430081)

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重組葡萄糖脫氫酶的表達及輔酶再生應用研究

李凌凌,劉曜寧,呂早生,楊忠華,左振宇,宋采薇

(武漢科技大學化學與化工學院,湖北 武漢,430081)

為解決異源表達酮還原酶域EryKR1的重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21(pET28a-eryKR1)催化環己酮還原時消耗的氫供體NADPH再生的問題，構建了克隆枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因gdh的重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)，其中的gdh基因經Nucleotide BLAST功能分析顯示與枯草芽孢桿菌9902的gdh基因序列(登錄號為EF626962.1)的一致性達到100%。SDS-PAGE檢測顯示該重組菌經IPTG誘導后可以高效表達出葡萄糖脫氫酶(GDH)，其表達量占全菌可溶性蛋白質的64%。GDH粗酶液的比酶活為137.90 U/mg。通過氣相色譜檢測添加了E.coliBL21(pET28a-gdh)的E.coliBL21(pET28a-eryKR1)環己酮還原反應體系中的環己醇含量，結果顯示加入重組GDH的雙重組菌耦合反應體系中環己醇的產率為82.21%，是未添加GDH的反應體系對應值的3.23倍，表明重組GDH可以為EryKR1還原環己酮系統解決輔酶再生問題。

葡萄糖脫氫酶；重組菌；異源表達；輔酶再生；生物催化；環己酮；枯草芽孢桿菌

利用氧化還原酶催化潛手性羰基化合物不對稱還原合成手性醇是生物技術中一個具有巨大發展前景的研究領域。但是，這個催化反應需要大量價格昂貴且穩定性低的輔酶協助才能進行，從而極大地阻礙了氧化還原酶的大規模應用，因此構建低成本、高效的輔酶再生系統是解決問題的關鍵[1]。解決輔酶再生的方法有化學法、電化學法、光化學法和酶法[2]，其中酶法更受青睞。酶法輔酶再生中負責將NAD(P)+轉化成NAD(P)H的酶有葡萄糖脫氫酶(GDH)和甲酸脫氫酶等。葡萄糖脫氫酶具有高穩定性和強特異性，而且能夠以廉價的葡萄糖為底物進行反應，因此有著廣泛的應用前景。目前，研究人員已經在巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、甲基營養菌、弱氧化醋酸桿菌、嗜酸熱原體等微生物中分離到了葡萄糖脫氫酶[3-6]，其中枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的產量高，純化方便，已被廣泛應用于輔酶的再生。酶法輔酶再生包括游離酶或固定化酶催化以及全細胞催化等方式[2]。游離酶或固定化酶催化具有可控性強、可連續操作且易于放大的特點，但其成本過高，酶的穩定性和壽命也有限；而全細胞催化省去了復雜的分離和純化步驟，操作比較方便。

克隆了糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1中酮還原酶域基因的重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21(pET28a-eryKR1)可以催化潛手性脂環酮的不對稱還原[7]，但此反應需要消耗大量昂貴的輔酶NADPH。本研究旨在構建重組表達枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌，通過基因工程手段實現葡萄糖脫氫酶的異源高效表達，并采用雙重組菌耦合的全細胞催化方法，解決酮還原酶域催化的還原反應中的輔酶再生問題(其中以環己酮替代潛手性脂環酮作為底物)，以期降低生產成本，提高市場價值。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒和培養基

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis168)、大腸桿菌表達載體pET28a質粒及重組菌E.coliBL21(pET28a-eryKR1)為本實驗室保藏；大腸桿菌BL21(E.coliBL21(DE3))為本實驗宿主菌，購自康為世紀生物科技有限公司。

LB培養基按照文獻[8]配制，用于培養大腸桿菌BL21和枯草芽孢桿菌。篩選抗性菌株時，加入終濃度為100 μg/mL的卡拉霉素。

1.1.2 主要試劑

Lysozyme、蛋白酶K、pfu DNA聚合酶、限制性內切酶NdeⅠ和EcoRⅠ、T4DNA連接酶、DNA Ladder Marker、Protein Marker、DNA Loading Buffer、微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及高純度質粒小提試劑盒均為康為世紀生物科技有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的PCR擴增

根據GenBank中登錄號為EF626962.1的枯草芽孢桿菌9902的葡萄糖脫氫酶基因序列設計合成引物。為了便于葡萄糖脫氫酶基因的克隆，在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點，并加上適量保護堿基，設計的引物如下：Gdh1X：5’-gccatatgTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCGTCGC-3’(gc為保護性堿基，catatg為NdeⅠ酶切位點)；Gdh2：5’-ggaattcTTAACCGCGGCCTGCCTGGAA-3’(g為保護性堿基，gaattc為EcoRⅠ酶切位點)。引物提交給武漢擎科創新生物科技有限公司合成。

PCR擴增體系：CTAB法提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA 2 μL，dNTP(each 2.5 mmol/L)2.5 μL，10×pfu DNA聚合酶緩沖液2.5 μL，DMSO 2.5 μL，引物Gdh1X(25 μmol/L)0.5 μL，引物Gdh2(25 μmol/L)0.5 μL，pfu DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，最后補無菌水至25 μL；PCR擴增程序參照文獻[7]。

1.2.2 枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的克隆

按照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的說明書回收純化PCR產物中的目標片段、PCR產物和質粒的雙酶切產物。按照高純度質粒小提試劑盒的說明書提取質粒。PCR擴增產物及載體的雙酶切、連接方法和連接產物的轉化方法按照文獻[9]進行。重組質粒由武漢擎科創新生物科技有限公司測序。

1.2.3 重組葡萄糖脫氫酶的誘導表達

按照5%的接種量將構建的重組菌種子液接種到50 mL含100 μg/mL 卡拉霉素的LB液體培養基中，37 ℃、150 r/min培養3 h左右加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)，30 ℃、150 r/min誘導6 h。離心(4 ℃，12 000g，10 min)收集菌體沉淀，用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗滌重懸后，超聲波破碎(400 W，工作3 s間歇5 s，10 min)。離心(4 ℃，12 000g，10 min)收集上清液(即粗酶液)，測定其酶活、蛋白質含量并進行SDS-PAGE電泳分析。

測定酶活的反應體系(3 mL)：粗酶液20 μL、20 mmol/L NADP+300 μL、125 mmol/L葡萄糖2.4 mL和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)280 μL。該體系置于37 ℃反應30 min，期間在340 nm下測量NADPH的吸光值變化曲線，根據曲線斜率計算單位時間內的NADPH含量變化情況。酶活單位U定義為在本實驗條件下，1 min催化還原1 μmol NADP+生成NADPH所需要的酶量。以上測定過程重復3次。采用Bradford法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品[8]；根據文獻[8]進行SDS-PAGE分析；

1.2.4 雙重組菌耦合發酵檢測輔酶再生系統能力

雙重組菌耦合的發酵體系(20 mL)：0.4 gE.coliBL21(pET28a-eryKR1)，0.1 gE.coliBL21(pET28a-gdh)，2.5 mg/mL 葡萄糖、0.2 mmol/L NADPH、16.6 μmol/mL 環己酮和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)。該體系置于30 ℃、100 r/min振蕩反應6 h。反應液離心(4 ℃，12 000g，10 min)收集上清液并用等體積乙酸乙酯萃取，按照文獻[7]的氣相色譜條件檢測有機相組分。

2 結果與分析

2.1 pET-gdh表達載體的構建

以提取的枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板、以Gdh1X和Gdh2的合成引物進行PCR擴增，產物的1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。由圖1可見，在750 bp附近存在目的片段，這與目標基因gdh的長度786 bp基本一致。對質粒pET28a和gdh基因的PCR回收產物進行雙酶切，回收后再進行連接反應。連接產物轉化到大腸桿菌BL21中，挑選出疑似陽性克隆，從中提取出質粒進行雙酶切鑒定，如圖2所示。質粒經雙酶切后，將其中連接長度約為750 bp的gdh基因片段切下來，證實了疑似陽性克隆中提取出來的質粒就是已克隆了枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的重組質粒pET28a-gdh，命名為E.coliBL21(pET28a-gdh)。

對重組質粒pET28a-gdh進行基因測序，利用NCBI數據庫中提供的Nucleotide BLAST功能根據測序結果進行搜索，結果顯示重組質粒pET28a-gdh上克隆的基因片段與枯草芽孢桿菌9902的葡萄糖脫氫酶基因序列(登錄號為EF626962.1)之間的相似度和覆蓋程度均達到100%。

圖1 PCR擴增產物電泳圖

Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products

圖2 疑似陽性克隆的雙酶切鑒定產物電泳圖

Fig.2 Electrophoretogram of the suspected positive clone by double enzyme digestion

2.2 重組葡萄糖脫氫酶的表達

利用SDS-PAGE檢測經IPTG誘導后的重組菌(E.coliBL21(pET28a-gdh))中葡萄糖脫氫酶的表達情況，如圖3所示。考慮到葡萄糖脫氫酶的分子大小約為28.8 kDa，加上表達蛋白中含有質粒pET28a的His-tag標簽，預計表達的重組葡萄糖脫氫酶的相對分子量約為33 kDa。實驗選擇的陰性對照有：未經過和經過IPTG誘導的E.coliBL21(pET28a)以及未經IPTG誘導的E.coliBL21(pET28a-gdh)。由圖3可知，同陰性對照相比，經IPTG誘導后的E.coliBL21(pET28a-gdh)檢測結果中，在相對分子量35.0 kDa附近有明顯的葡萄糖脫氫酶表達條帶，此點與目標蛋白的相對分子量33 kDa一致，表明葡萄糖脫氫酶在重組菌中高效表達。根據BandScan 5.0軟件分析SDS-PAGE圖，可知葡萄糖脫氫酶(圖3中的孔道4)的表達量占重組菌總可溶性蛋白質的64%。

圖3 重組葡萄糖脫氫酶的SDS-PAGE檢測結果

Fig.3 SDS-PAGE result of recombinant glucose dehydrogenase

將重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)的粗酶液在適當體系(pH7.0)中37 ℃反應30 min(以E.coliBL21(pET28a)作為陰性對照)，測定反應體系在340 nm處的吸光值變化，獲得酶催化反應的進程曲線。根據曲線中0～2 min內線性階段的斜率可得出吸光值的變化率ΔA=0.75 min-1，結合NADPH標準曲線擬合的公式(y=0.004 83x+0.004 53，R2=0.999 82，其中y為340 nm處的吸光值，x為NADPH濃度(μmol/L))，可計算出單位時間內NADPH的濃度變化情況，從而得出粗酶液的酶活為23 291.95 U/L，而陰性對照的酶活僅為50.84 U/L。

采用Bradford法測定該重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)破胞上清液中的蛋白質濃度，根據BSA標準品的濃度與吸光值之間的標準曲線(y=0.005 79x-0.064，R2=0.997 01，y為595 nm處的吸光值，x為蛋白質含量(μg/mL))，測得其中蛋白質濃度為168.91 μg/mL，由此得出粗酶液的比酶活為137.90 U/mg，而陰性對照的蛋白質濃度為63.90 μg/mL，比酶活只有0.80 U/mg。

目前，很多研究人員測定了在大腸桿菌中異源表達枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶的酶活特性。例如：周麗萍等[10]利用重組葡萄糖脫氫酶的初提液測定的比酶活為10 U/mg；徐軍等[11]通過優化表達條件將重組酶的比酶活從10 U/mg提高到97 U/mg；Qiao等[12]構建的重組葡萄糖脫氫酶的比酶活為7.8 U/mg；徐嫻等[13]通過優化誘導時間、溫度等條件得出重組葡萄糖脫氫酶的比酶活為9.65 U/mg；李鳴等[14]構建的重組菌破碎細胞上清液葡萄糖脫氫酶比酶活為65.7 U/g。本課題組前期構建了克隆枯草芽孢桿菌AB90008中葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌，其中酶的第124位殘基上發生絲氨酸→半胱氨酸的突變，粗酶液的比酶活僅為18.4 U/mg[7]。為了獲得更適合環己酮還原體系輔酶再生應用的酶活較高的重組菌，本研究重新選擇枯草芽孢桿菌168作為葡萄糖脫氫酶基因的供體菌，從上述檢測結果來看，重組菌表達的葡萄糖脫氫酶的酶活和比酶活要遠遠高出其他報道及本課題組前期構建的重組菌的相應數據。

2.3 重組葡萄糖脫氫酶的輔酶再生性能

E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)中的酮還原酶域EryKR1以NADPH為氫供體還原環己酮，生成環己醇，在此過程中NADPH被氧化成NADP+。要想此反應能夠循環反復，就必須往反應體系中不斷添加還原型輔酶NADPH或是完成NADP+的再次還原(即還原性輔酶的再生)。重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)表達的葡萄糖脫氫酶能夠通過氧化葡萄糖將NADP+還原成NADPH。

為了檢測重組葡萄糖脫氫酶在環己酮還原反應體系中的輔酶再生性能，將E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)和E.coliBL21(pET28a-gdh)雙重組菌耦合進行環己酮的發酵，利用氣相色譜檢測發酵液中環己酮和環己醇的濃度(見圖4)，從而計算出相應的環己醇產率(見表1)。

由表1可知，當環己酮還原反應系統中只加E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)和NADPH(第4組)時，環己醇產率很低，僅為5.22%；而當體系中加入E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)、E.coliBL21(pET28a-gdh)、葡萄糖和NADPH(第1組)時，環己醇的產率高達82.21%。以E.coliBL21(pET28a)還原環己酮的反應體系作為陰性對照，其中幾乎檢測不出環己醇的含量。由于大腸桿菌中生成的NADPH較少，還原再生NADPH的能力很弱，因此，對于第3組和第4組沒有添加GDH輔酶再生系統的環己酮還原體系，環己醇產率和環己酮轉化率均很低，表明靠一次性添加外源性的NADPH無法從根本上滿足環己酮還原反應對氫供體的需求。通過第1組和第3組的對比可知，E.coliBL21(pET28a-gdh)的加入可使環己醇的產率提升2.23倍；第2組的數據表明，即使不添加外源性NADPH，利用大腸桿菌宿主菌中生成的少量NADPH，GDH也能完成輔酶再生循環，為環己酮還原反應源源不斷地提供氫供體；對比第1組和第2組的數據可知，外源性NADPH的加入可以使環己醇的產率提升22.5%左右，因此在存在GDH輔酶再生系統的條件下，額外地添加NADPH可以使得輔酶再生循環的基數提高，導致氫供體的增長速率加快，進而提高環己醇的產率。綜上所述，本實驗構建的重組菌E.coliBL21(pET28a-gdh)表達的葡萄糖脫氫酶可以解決E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)催化環己酮還原體系的輔酶再生問題。

(a)第1組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+E.coliBL21(pET28a-gdh)+葡萄糖+NADPH

(b)第2組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+E.coliBL21(pET28a-gdh)+葡萄糖

(c)第3組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+葡萄糖+NADPH

(d)第4組：E.coliBL21 (pET28a-eryKR1)+ NADPH

圖4 環己酮發酵液的氣相色譜圖

Fig.4 Gas chromatography of cyclohexanone fermentation brothes

表1 重組葡萄糖脫氫酶在環己酮還原體系中的輔酶再生性能檢測結果

利用基因工程技術實現葡萄糖脫氫酶的高效表達，并構建葡萄糖脫氫酶與羰基還原酶耦聯的輔酶循環系統，可以解決生物催化潛手性羰基不對稱還原中的輔酶再生問題。目前，這一輔酶再生方法已經被廣泛地應用到很多手性化合物的合成中。例如：一些研究人員構建的葡萄糖脫氫酶與羰基還原酶耦聯的輔酶再生體系可以催化4-氯乙酰乙酸乙酯還原生成4-氯-3-羥基丁酸乙酯，其中產率最高可以達到99%[6,15-16]；Gao等[17]完成了枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶和氧化葡糖桿菌NADPH依賴的羰基還原酶在同一大腸桿菌中耦聯表達，這種一菌雙酶的輔酶再生系統可以在75 min內還原14.3 g/L雙乙酰生成12.2 g/L (S)-3-羥基丁酮；Ema等[18]實現了釀酒酵母羰基還原酶和巨大芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的共表達，合成了20種醇，其中(S)-2-羥基-4-辛酮的產率為71%；李鳴等[14]共表達了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶，建立了雙酶耦聯反應，其中產物(R)-4-甲氧基-1-苯乙醇的產率高達82%；宿宇寧等[19]將來源于枯草芽孢桿菌的羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中共表達，對10 g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯進行不對稱還原，轉化率大于99%；歐陽健等[20]將羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶耦聯再生NADPH不對稱合成(S)-1-苯基-1,2-乙二醇，轉化率達到90.91%。本研究將構建的異源表達葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌添加到克隆了酮還原酶域基因的重組菌的環己酮還原反應體系中，環己醇產率可以達到82.21%。根據本課題組前期的研究成果，此雙重組菌耦聯體系可以還原潛手性脂環酮(如2-甲基環己酮、1,2-環己二酮等)[21-22]，說明葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶的耦聯除了可以應用到4-氯-3-羥基丁酸乙酯等重要手性砌塊的合成中之外，還有望為工業生產藥物中間體——含環己基的手性醇解決輔酶再生問題。

3 結論

(1)構建了異源表達枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌，其中克隆的葡萄糖脫氫酶基因gdh經Nucleotide BLAST功能分析顯示與枯草芽孢桿菌9902的gdh基因(登錄號為EF626962.1)的序列一致性達到100%。

(2)實現了重組型葡萄糖脫氫酶的高水平表達，表達量占全菌可溶性蛋白質的64%，且粗酶液的比酶活達到137.90 U/mg。

(3)建立了異源表達葡萄糖脫氫酶和酮還原酶域的雙重組菌耦合還原環己酮的反應體系，其中環己醇的產率高達82.21%。由此可解決環己酮還原反應中的輔酶再生問題，促進酮還原酶域在潛手性脂環酮不對稱還原中的工業應用。

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[責任編輯 尚 晶]

Expression of recombinant glucose dehydrogenase and its application to coenzyme regeneration

LiLingling,LiuYaoning,LvZaosheng,YangZhonghua,ZuoZhenyu,SongCaiwei

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China)

To solve the regeneration of hydrogen donor NADPH for cyclohexanone reduction catalyzed by the recombinant strainEscherichiacoliBL21 (pET28a-eryKR1) heterologously expressing ketoreductase domain (EryKR1), the recombinant strainE.coliBL21 (pET28a-gdh) was constructed which cloned the glucose dehydrogenase(GDH) genegdhfromBacillussubtilis. BLAST analysis showed that nucleotide sequence of the genegdhin the recombinant strain had the consistency of 100% with that ofB.subtilisstrain 9902 (accession number EF626962.1). SDS-PAGE analysis revealed that GDH could be highly expressed in the recombinant strain induced by IPTG, which accounted for 64% of the total soluble protein. Specific activity of GDH crude enzyme was 137.90 U/mg. Recombinat strainE.coliBL21(pET28a-gdh) was added to the cyclohexanone reduction reaction catalyzed byE.coliBL21(pET28a-eryKR1). Gas chromatography analysis showed that the yield of cyclohexanol in the two-recombinant strain reaction system was 82.21% and 3.23 times that of the system withoutE.coliBL21(pET28a-gdh), which confirmed that recombinant GDH could solve the coenzyme regeneration problem for cyclohexanone reduction catalyzed by ketoreductase domain.

glucose dehydrogenase; recombinant strain; heterologous expression; coenzyme regeneration; biocatalysis; cyclohexanone;Bacillussubtilis

10.3969/j.issn.1674-3644.2017.02.014

2016-12-26

國家自然科學基金資助項目(21376184);武漢科技大學青年科技骨干培育計劃項目(2016XZ014);武漢科技大學大學生科技創新基金研究項目(16ZRA044).

李凌凌(1981-)，女，武漢科技大學副教授，博士. E-mail:moonletsmile@163.com

Q789；TQ925

A

1674-3644(2017)02-0155-06