一次性腹腔注射Diquat誘導構建肉仔雞慢性氧化應激模型

李 馳，閆 峻，穆淑琴，馬 墉，鄭 梓，高玉鵬

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；3.天津市畜禽健康養殖技術工程中心，天津 300381)

一次性腹腔注射Diquat誘導構建肉仔雞慢性氧化應激模型

李 馳1，閆 峻2,3，穆淑琴2,3，馬 墉2,3，鄭 梓2,3，高玉鵬1

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381；3.天津市畜禽健康養殖技術工程中心，天津 300381)

通過對肉仔雞一次性腹腔注射Diquat，研究試驗期間肉仔雞的生長性能、部分血液生化指標和抗氧化指標的變化，建立肉仔雞慢性氧化應激模型。選取300只20日齡的健康科寶肉仔雞，隨機分為2組，每組15個重復，每重復10只雞，公母各半。試驗期共21 d。試驗第1 天，處理組按照體質量以8 mg/kg一次性腹腔注射Diquat，對照組注射相應劑量的無菌生理鹽水。所有雞自由采食和飲水，在試驗第1、12、21 天，空腹12 h，然后前腔靜脈采血分離血清，測定血清中的生化指標和抗氧化指標。結果顯示，Diquat處理組的平均日增量和平均日采食量顯著低于對照組，料體質量比有增高的趨勢；血清中ALT、AST、GSH-Px、SOD和COR活性顯著高于對照組，MDA濃度顯著低于對照組。表明，按照8 mg/kg體質量一次性腹腔注射Diquat溶液可以誘導肉仔雞產生氧化應激，并且應激效應可持續21 d，血清中ALT、AST、GSH-Px、COR、SOD和MDA的含量變化可以作為反映氧化應激的敏感指標。

Diquat；肉仔雞；氧化應激；模型

動物機體內會不斷產生活性氧自由基(ROS)和抗氧化物質，并且兩者處于動態平衡狀態。當外來因素或動物機體內部異常引起機體產生的活性氧自由基過多，導致其無法被機體產生的抗氧化物質及時清除，動態平衡遭到破壞，就會對機體造成影響，產生氧化應激，過多的氧自由基會結合并破壞生物大分子，造成大分子物質功能紊亂，進而引起細胞結構和生物功能的異常[1-2]。斷奶、免疫、細菌病毒侵襲、氣候環境變化等多種因素均可誘導畜禽產生氧化應激，不同程度降低畜禽的生產性能和健康程度，誘發多種疾病，甚至造成動物死亡，從而增加生產成本，降低經濟效益，給養殖業造成巨大損失[3]。

為深入研究氧化應激的生物學效應和抗應激措施，學者利用地塞米松等藥物構建慢性氧化應激模型，但存在重復多次注射、氧化應激狀態不穩定、操作繁瑣等問題，因此，建立穩定可靠、易于操作的肉仔雞慢性氧化應激模型十分重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選取健康、體質量相近(0.87 kg±0.10 kg)的20日齡科寶肉仔雞300只。

體積分數為25%的Diquat溶液由天津市農業科學院植物保護研究所提供。

1.2 試驗設計

300只健康科寶肉仔雞隨機分為2組(處理組和對照組)，每組15個重復，每個重復10只雞，公母各半。試驗期21 d。試驗第1 天，處理組按照8 mg/kg體質量一次性腹腔注射Diquat溶液，對照組注射相應劑量的無菌生理鹽水。在試驗第1、12、21 天空腹前腔靜脈采血，分離血清，測定血清中的生化指標和抗氧化指標。

1.3 試驗飼糧

以玉米、豆粕等為原料配制基礎日糧，營養水平參照中國肉雞飼養標準(NY-T 33-2004)，21～42 d飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basic diet(DM basic)

注：預混料每千克提供：銅 8 mg，鐵 100 mg，鋅 100 mg， 錳 120 mg，鈷 1.0 mg，碘 0.4 mg，硒 0.4 mg，維生素A 8 330 IU，維生素D 1 440 IU，維生素E 30 IU，維生素B12.0 mg，維生素B28 mg，維生素B61.2 mg，維生素B120.03 mg，煙酸 40 mg，泛酸 20 mg，葉酸 2.0 mg，生物素 0.2 mg。代謝能為計算值，其余為實測值。

Note:Per kg of premix providing:Cu 8 mg,Fe 100 mg,Zn 100 mg,Mn 120 mg,Co 1.0 mg,I 0.4 mg,Se 0.4 mg,vitamin A 8 330 IU,vitamin D 1 440 IU,vitamin E 30 IU,vitamin B12.0 mg,vitamin B28 mg,vitamin B61.2 mg,vitamin B120.03 mg,nicotinic acid 40 mg,pantothenic acid 20 mg,folic acid 2.0 mg,biotin 0.2 mg.ME was a calculated value,and the others were measured values.

1.4 飼養管理

試驗在天津市現代畜牧業創新示范基地進行。籠上平養，自由采食和飲水。雞舍自然通風，保持衛生，定期消毒，光照24 h/d。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 生產性能 每天統計記錄飼料消耗量，試驗第1 天和第21 天，以重復為單位稱量試驗雞的空腹體質量，計算全期的平均日增量(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料肉比(F/G)。

平均日增量=(終末體質量-初始體質量)/試驗時間

平均日采食量=總采食量/試驗時間

料肉比=平均日采食量/平均日增量

1.5.2 相關血清生化指標 在試驗的第1、12、21 天，空腹12 h，前腔靜脈采集血液5 mL，于37 ℃水浴鍋里傾斜放置30 min后，4 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存，待測。谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)使用東芝120生化檢測儀檢測。

1.5.3 血清抗氧化酶 血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、皮質醇(COR)用XH6080放免儀檢測。

1.6 數據分析與處理

首先利用Microsoft Office Excel 2010軟件對數據進行初步整理，然后用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan’s法進行顯著性檢驗，數據以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 一次性腹腔注射Diquat對肉仔雞生產性能的影響

由表2可知，與對照組相比，處理組的平均日增量降低31.58%，平均日采食量降低22.64%，且均顯著低于對照組(P<0.05)；處理組的料肉比增加12.63%，有增高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 肉仔雞生產性能Table 2 Performance of broiler chickens

注：同行數據小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

Notes：In the same row,values with different lowercase letter mean significant difference (P<0.05).The same as below.

2.2 一次性腹腔注射Diquat對肉仔雞血清生化指標的影響

由表3可知，試驗第1 天，處理組血清中ALT活性高于對照組30%，AST活性高于對照組75%；試驗第12 天，處理組血清中ALT高于對照組26%，AST高于對照組76%；試驗第21 天，處理組血清中ALT高于對照組40%，AST高于對照組57%。且所有監測點處理組血清中ALT和AST的活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 肉仔雞血清生化指標Table 3 Serum chemistry of broiler chickens IU/L

2.3 一次性腹腔注射Diquat對肉仔雞血清抗氧化指標的影響

由表4可知，試驗第1 天，處理組血清中GSH-Px活性低于對照組8%，SOD活性低于對照組14%，MDA濃度高于對照組20%，COR質量濃度高于對照組59%；試驗第12 天，處理組血清中GSH-Px低于對照組8%，SOD低于對照組15%，MDA高于對照組17%，COR高于對照組46%；試驗第21 天，處理組血清中GSH-Px低于對照組7%，SOD低于對照組15%，MDA高于對照組22%，COR高于對照組39%。且所有監測點處理組血清中GSH-Px和SOD活性均顯著低于對照組，MDA和COR水平均顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 Diquat對肉仔雞生產性能的影響

Diquat是一種具有較強毒性的化合物，屬于氧化還原型雙吡啶基除草劑，具有刺激性。腹腔注射直接進入動物機體，被動物腸道系膜消化、吸收，可引起機體利用血液內的分子氧產生氧自由基，破壞細胞膜結構，影響細胞正常生理功能，消化道黏膜受損，通透性增高，造成腸道感染，誘發腸道疾病，表現為采食量降低，平均日增量減小，降低動物生產性能[6-7]。有研究表明，通過一次性腹腔注射12 mg/kg BW Diquat，可以誘導仔豬產生氧化應激而不會引起動物死亡[8-9]。在本試驗中，肉仔雞一次性腹腔注射Diquat后，所有試驗雞均出現食欲減退、拉稀等現象，4～5 d后恢復采食。對照組未出現拉稀現象且采食情況良好。本研究結果表明，試驗組平均日采食量和平均日增量均顯著降低，料肉比增高，研究結果與Zheng等[10]報道一致。

表4 肉仔雞血清氧化指標Table 4 Oxidative indices of broiler chickens

3.2 Diquat對肉仔雞血清生化指標的影響

肝臟異常誘發的疾病常與自由基代謝有關[11]。一次性腹腔注射Diquat對肉仔雞造成氧化應激，主要集中于肝臟受損[12]。ALT和AST主要分布于肝組織中，正常情況下，細胞的屏障作用可以阻止其逸出，少量可跟隨細胞的更新釋放入血液中；異常情況下，機體組織細胞膜受到氧化損傷，細胞膜的完整性遭到破壞，通透性增加，ALT、AST大量滲入血液中，造成其含量增高，因此血液中的ALT、AST的含量可以反映肝細胞的損傷程度。本試驗的第1、12、21 天試驗組血清中ALT、AST含量顯著高于對照組，說明Diquat對肉仔雞肝臟造成損傷，引起氧化應激，導致血清中ALT和AST含量顯著升高，這與劉波等[13]、Strange[14]得出的結論一致。

3.3 Diquat對肉仔雞抗氧化能力的影響

外源性化學物質屬于體外異物，進入機體，對機體造成氧化損傷，機體會產生相應的防御機制來對抗損傷，使其被不斷清除，維持機體平衡。平衡遭到破壞，有害物質累積就會造成有機體防御功能紊亂。SOD、GSH-PX和MDA是機體內最主要的抗氧化物質和氧化物質[15]。SOD可以減少體內的超氧陰離子自由基，使其轉化為H2O2；GSH-PX可以清除脂類和有機類氫過氧化物，因此，SOD和GSH-PX可以作為間接反應生物體體內抗氧化狀態的標志性物質[16]。機體細胞損傷產生的氧自由基可氧化生物膜中的多不飽和脂肪酸，形成脂質過氧化物MDA等物質，MDA含量可以做為機體內的脂質氧化指標，反映細胞損傷的程度[17]。COR由腎上腺皮質分泌，主要調節體內糖和蛋白質的代謝，可以抑制肌肉和脂肪組織從血液中攝取葡萄糖；促進肌肉蛋白分解，增強脂肪組織水解；促進糖異生和肝糖原、肌糖原的分解，以維持血糖水平。本研究結果表明，第1，12，21 天處理組血清中SOD、GSH-Px和COR含量均顯著低于對照組，MDA含量顯著高于對照組，這與陳剛[18]的報道一致，說明Diquat引起肉仔雞的氧化應激，造成體內氧自由基過多，引起脂質氧化。

4 結 論

按照8 mg/kg體質量給肉仔雞一次性腹腔注射Diquat，可以誘導肉仔雞產生氧化應激，并且應激效應可持續21 d以上；血清中ALT、AST、GSH-Px、COR、SOD和MDA的含量變化可以作為反映氧化應激的敏感指標。

Reference：

[1] 王永闖,肖興軍.氧化應激在周圍神經病變發病機制中的作用[J].卒中與神經疾病,2016,23(1):73-74.

WANG Y CH,XIAO X J.The role of oxidative stress in the pathogenesis of peripheral neuropathy [J].StrokeandNervousDiseases,2016,23(1):73-74(in Chinese).

[2] 吳艷萍,王 陽,李雅麗,等.氧化應激與自噬[J].動物營養學報,2016,28(9):2673-2680.

WU Y P,WANG Y,LI Y L,etal.Oxidative stress and autophagy [J].ChineseJournalofAnimalNutrition,2016,28(9):2673-2680(in Chinese with English abstract).

[3] 朱若岑,蔣維維,譚柱良,等.動物體內活性氧、氧化應激與細胞凋亡以及抗氧化劑研究進展[J].中獸醫醫藥雜志,2015(3):21-25.

ZHU R C,JIANG W W,TAN ZH L,etal.Progress of reactive oxygen species,oxidative stress,cell apoptosis and antioxidant in animals [J].JournalofTraditionalChineseVeterinaryMedicine,2015(3):21-25(in Chinese with English abstract).

[4] 趙 嬌,陳代文,毛湘冰,等.葡萄籽原花青素對Diquat誘導氧化應激仔豬生長性能及血清和肝臟氧化還原狀態的影響[C]//中國畜牧獸醫學會動物營養學分會第十一次全國動物營養學術研討會論文集,成都:四川農業大學,2012:508.

ZHAO J,CEHN D W,MAO X B,etal.Effect of grape seed extract on growth performance,serum and liver redox status of diquat induced oxidative stress in piglets [C]//Animal Nutrition Branch of China Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Proceedings of the Eleventh National Symposium on Animal Nutrition,Chengdu:Sichuan Agricultural University,2012:508(in Chinese).

[5] 徐 靜,余 冰,陳代文.Diquat誘導的生長豬氧化應激持續時間及適宜的應激標識[J].中國農業科學,2008,41(12):4359-4364.

XU J,YU B,CHEN D W.Duration and indicators of oxidation stress induced by diquat in growing pigs [J].ScientiaAgriculturaSinica,2008,41(12):4359-4364(in Chinese with English abstract).

[6] 王嘯春,陳小連,趙珂立,等.動物腸道氧化應激及抗氧化劑干預作用研究進展[J].中國畜牧雜志,2011,47(11):73-78.

WANG X CH,CHEN X L,ZHAO K L,etal.Recent advance in oxidative stress in intestinal tract and inter vention of antioxidants [J].ChineseJournalofAnimalScience,2011,47(11):73-78(in Chinese with English abstract).

[7] CLARK D G,HURST E W.The toxicity of diquat [J].BritishJournalofIndustrialMedicine,1970,27(1):51-55.

[8] 李麗娟,陳代文,余 冰,等.氧化魚油和敵草快對斷奶仔豬肌體氧化還原狀態的影響[J].動物營養學報,2007,19(3):199-203.

LI L J,CHEN D W,YU B,etal.Effects of oxidized fish oil and diquat on the organism of weanling pigs [J].ChineseJournalofAnimalNutrition,2007,19(3):199-203(in Chinese with English abstract).

[9] 袁施彬.仔豬氧化應激及硒的抗應激效應和機理的研究[D].四川雅安:四川農業大學,2007.

YUAN SH B.Investigation of oxidation-stress of piglets and the role of selenium on anti-stress response [D].Ya’an Sichuan:Sichuan Agricultural University,2007(in Chinese with English abstract).

[10] ZHENG P,YU B,HE J,etal.Protective effects of dietary arginine supplementation against oxidative stress in weaned piglets [J].BritishJournalofNutrition,2013,109(12):2253-2260.

[11] LEE W M.Drug-induced hepatotoxicity [J].AlimentaryPharmacology&Therapeutics,1993,333(5):1118-1127.

[12] 劉 通.日糧添加L-茶氨酸對斷奶仔豬的抗應激效果研究[D].陜西楊凌:西北農林科技大學,2016.

LIU T.Study on the effect of dietary supplement of L-theanine on anti stress in weaned piglets [D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2016(in Chinese with English abstract).

[13] 劉 波,王美垚,謝 駿,等.低溫應激對吉富羅非魚血清生化指標及肝臟 HSP70基因表達的影響[J].生態學報,2011,31(17):4866-4873.

LIU B,WANG M Y,XIE J,etal.Effects of acute cold stress on serum biochemical and immune parameters and liver HSP70 gene expression in GIFT strain of Nile tilapia[J].ActaEcologicaSinica,2011,31(17):4866-4873(in Chinese with English abstract).

[14] STRANGE R J.Corticoid stress responses to handling and temperature in salmonids [J].TransactionsoftheAmericanFisheriesSociety,2011,106(3):213-218.

[15] 亢玉靜,郎明遠,趙 文.水生生物體內抗氧化酶及其影響因素研究進展[J].微生物學雜志,2013,33(3):75-80.

KANG Y J,LANG M Y,ZHAO W.Advance in antioxidant enzymes and its effect factors in aquatic organisms [J].JournalofMicrobiology,2013,33(3):75-80(in Chinese with English abstract).

[16] 韓 倩,張麗娟,胡國成,等.十溴二苯乙烷對草魚幼魚肝臟和肌肉組織氧化應激效應的影響[J].生態毒理學報,2016,11(2):680-686.

HAN Q,ZHANG L J,HU G CHetal.Oxidative stress effects of decabromodiphenylethane on the liver and muscle tissues of juvenile grass carp [J].AsianJournalofEcotoxicology,2016,11(2):680-686 (in Chinese with English abstract).

[17] 張 旭,蔣桂韜,王向榮,等.姜黃渣對蛋雞生產性能、蛋品質及蛋黃膽固醇和丙二醛含量的影響[J].動物營養學報,2016,28(9):2795-2801.

ZHANG X,JIANG G T,WANG X R,etal.Effects of turmeric residue on performance,egg quality and the contents of cholesterol and malondialdehyde in yolk of laying hens [J].ChineseJournalofAnimalNutrition,2016,28(9):2795-2801(in Chinese with English abstract).

[18] 陳 剛.止痢草油緩解斷奶仔豬腸道氧化應激的作用及機制[D].武漢:華中農業大學,2015.

CEHN G.Effect and mechanism of oregano essential oil reduce intestinal oxidative stress in weaned pigs [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2015(in Chinese with English abstract).

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

The Construction Model of Chronic Oxidative Stress in Broilers Induced by Intraperitoneal Injection of Diquat

LI Chi1,YAN Jun2,3,MU Shuqin2,3,MA Yong2,3,ZHENG Zi2,3and GAO Yupeng1

(1.College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China；2.Tianjin Animal Science and Veterinary Research Institute,Tianjin 300381,China; 3.Tianjin Livestock and Poultry Health Aquaculture Engineering Center,Tianjin 300381,China)

By studying the effects of intraperitoneal injection of Diquat on broiler growth performance,biochemical index of blood and antioxidant,proven oxidative stress duration and serum index,establish chronic oxidative stress model.Three hundred 20-day-old healthy Cobb broilers were randomly divided into 2 treatments with 15 replicates of 10 chickens in each replicate,half male and half female.Chickens in group 1 or 2 were intraperitoneally injected with diquat at a dose of 8 mg/kg BW or saline.They were allowed ad libitum to feed and water.The whole trial period was 21 days.Serum was collected on 1,12 and 21 day for determination of superoxide and anti-oxidative enzyme activities.Diquat injection reduced ADG and ADFI,F/G had an increasing trend but the difference was not significant;serum ALT and AST activity was significantly higher than the control group; serum GSH-Px,SOD and COR levels were significantly higher than the control group,MDA was significantly lower than the control group.Oxidation stress resulted from intraperitoneal injection of diquat (8 mg/kg) would last for up to 21 days.Serum ALT,AST,SOD,GSH-Px,COR activities and MDA content were sensitive indicators for oxidation stress.

Diquat; Broilers; Oxidative stress; Model

LI Chi,male,master student.Research area:animal nutrition and feed science.E-mail:lichi93@163.com

GAO Yupeng,male,Ph.D,professor.Research area:poultry nutrition and production technology.E-mail:gaoyupeng112@sina.com

日期：2017-03-30

2016-11-21

2016-12-20

“十二五”農村領域國家科技計劃(2012BAD39B01-3)；國家自然科學基金(31402097)。

李 馳，男，碩士研究生，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：lichi93@163.com

高玉鵬，男，教授，博士生導師，研究方向為家禽營養與生產技術。E-mail：gaoyupeng112@sina.com 閆 峻，男，博士，副研究員，研究方向為單胃動物營養與健康養殖技術。E-mail：yjjsxz@163.com

S831.5

A

1004-1389(2017)04-0509-05

YAN Jun,male,associate research fellow.Research area:single stomach animal nutrition and healthy culture technology.E-mail:yjjsxz@163.com

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.008.html

Received 2016-11-21 Returned 2016-12-20

Foundation item The Key Sci-tech Project of the “12th 5-year-plan” of China (No.2012BAD39B01-3); the National Natural Science Foundation of China (31402097).