MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達變化及臨床意義

李 菲

MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達變化及臨床意義

李 菲

目的 比較MicroRNA-101(miR-101)、L型鈣通道β2(L-type calcium channel β2Subunit，CACNB2)及鈉鈣交換體(NCX)在房顫(AF)病人血清中的表達變化，并分析其臨床意義。 方法 篩選2014年3月—2015年3月來就診的100例AF病人為研究對象，設為試驗組(n=100)；同時選取100例正常病人作為空白對照組(n=100)。試驗時，分別應用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式技術(Real-Time quantity PCR)和免疫印跡(Western blot)方法檢測兩組右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達水平變化，探討miR-101 與CACNB2、NCX表達水平的相關性，闡述 miR-101 在房顫發(fā)生與維持中可能機制及臨床檢測意義。 結果 ①治療前，兩組受試者在年齡、性別、手術方式等臨床資料比較無有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，試驗組左房內徑(58.9±7.2)mm，大于對照組(37.9±8.1)mm，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②實時熒光定量 PCR結果表明，AF病人右心耳組織中的microRNA-101表達量(0.620 7±0.132 1)，較正常病人(2.310 0±0.342 2)低；AF病人右心耳組織中的CACNB2、NCX通道m(xù)RNA表達量(1.980 0±0.315 1，1.802 7±0.281 1)，較正常病人(0.752 6±0.383 0，0.602 1±0.291 1)表達量高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫印跡(Western blot)結果表明，AF病人右心耳組織中的CACNB2和NCX蛋白的表達水平(1.36±0.18，1.46±0.12)均較正常病人(1.10±0.25，1.06±0.21)高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論 AF病人右心耳組織中 miR-101的表達水平與AF的發(fā)生具有相關性，CACNB2、NCX通道是miR-101的靶向調控位點，參與AF的發(fā)生。

房顫；MicroRNA-101；L型鈣通道β2；鈉鈣交換體

房顫(AF)是臨床中常見的一種心房電生理紊亂疾病，病人表現(xiàn)為無序的快速心房顫動，失去心肌的正常收縮、舒張功能，容易引發(fā)心功能受損、血栓等嚴重并發(fā)癥。 微小 RNA(microRNAs)在AF的發(fā)生過程中具有重要作用，其中microRNA-101(miR-101)是AF疾病表征的重要指標[1-2]。L 型鈣通道β2亞基(CACNB2)[3]和鈉鈣交換體(NCX)[4]的表達水平變化可能與miR-101的水平變化有緊密聯(lián)系，成為導致AF的重要原因，但是一直沒有相關報道進行研究證實。本次研究針對AF病人右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達水平變化進行檢測，初步探討了miR-101 與CACNB2、NCX表達水平的相關性及miR-101在AF疾病發(fā)生中的可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選取2014年3月—2015年3月就診的AF病人，采集病史并完善術前檢查，共選出100例AF病人作為試驗組，男性50例，女性50例，年齡30歲～55歲(40.28歲±5.17歲)。同時篩選100例正常病人作為空白對照，男性47例，女性53例，年齡30歲～55歲(40.30歲±4.87歲)。所有參試者均自愿簽訂同意書，參加本次研究。

1.1.2 入選標準 臨床確診為AF病人。排除標準：口服鈣離子拮抗劑；感染性心內膜炎和風濕性疾病；糖尿病；肝腎功能障礙；各種精神疾患。

1.1.3 失聯(lián)原因及其應對措施 預計原因為中途退出試驗或者在試驗過程中轉院治療；應對措施為按照1∶1比例相應補充受試病人進試驗組。

1.1.4 倫理學考量 病人及其直系家屬在充分了解研究過程的基礎上簽署參與該臨床研究的知情同意書；相關診治和監(jiān)護措施均以臨床指南相關原則為依據，對病人的醫(yī)療治療和安全有充分保障；對信息及診療記錄予以保密，保護隱私權；試驗過程遵循《渥太華工作組關于臨床試驗注冊的聲明》(Ottawa Group Statement for Clinical Trial Registration)。

1.1.5 雙盲原則 研究人員分為4組：第一組研究人員負責篩選和隨機分配試驗對象；第二組負責施行疼痛治療；第三組負責進行觀察指標數據采集；第四組負責數據的整理和統(tǒng)計分析以及文章撰寫。試驗對象的分組情況嚴格保密：試驗對象和具體施行鎮(zhèn)痛治療的研究人員均不清楚試驗對象的具體分組。4個研究組的研究人員對各自的操作互相保密。

1.2 方法 將100例AF病人設為試驗組(n=100)，100例正常病人作為空白對照組(n=100)。試驗時，應用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式技術(Real-Time quantity PCR)和免疫印跡(Western blot)方法，檢測右心耳組織中 miR-101和CACNB2、NCX的表達水平變化，探討miR-101 與CACNB2、NCX表達水平的相關性。

1.2.1 檢測方法 灌注心肌停搏液前剪取200 g左右右心耳組織，用冰生理鹽水洗凈后剪成兩部分，分別置于兩個凍存管中(不含RNA酶)，迅速放入液氮中凍存，凍實后快速置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 PCR檢測miR-101表達水平 將-80 ℃冰箱中保存的右心耳組織取出稱重，冰上剪碎后加入1 mL的Buffer RLM 組織裂解液；片刻后，將裂解液轉移到DEPC 處理水處理過的 5 mL 勻漿管中，將組織充分粉碎、混勻，室溫下放置5 min；待組織充分裂解后，加入200 μL 氯仿，振蕩 15 s 后室溫靜置 5 min。再將裂解液置于4 ℃離心機中12 000 r/min離心15 min，取上層無色水相置于1.5 mL EP管中，加入1/2體積的無水乙醇，混勻后轉入收集管(Collection Tube 2 mL)內的吸附柱R(Mspin Column RM)中，4 ℃離心機中12 000 r/min離心30 s，收集流出液，加入2/3體積無水乙醇，混勻后轉入吸附柱RS中，4 ℃離心機中12 000 r/min離心30 s后，將吸附柱RS重新放入收集管中，加入 700 μL Buffer RWT，4 ℃離心機中12 000 r/min離心30 s后，再次向吸附柱RS中加入500 μL LBuffer RW2，4 ℃離心機中12 000 r/min離心30 s后，重復加入500 μL Buffer RW2，4 ℃離心機中12 000 r/min離心1 min后，將吸附柱 RS 置于室溫下晾干。最后，將吸附柱 RS 置于干凈1.5 mL 離心管中，加入 20 μL～30 μL RNase-Free Water，室溫下靜置 1 min，4 ℃離心機中12 000 r/min離心1 min后，收集溶液，測定總microRNA 濃度和純度。通過microRNA逆轉錄得到cDNA，進行熒光定量 PCR。熒光定量 PCR使用美國ABI7500 實時熒光定量PCR儀完成，每樣設定3個平行，嚴格按照說明操作。

1.2.3 免疫印跡(Western blot)法 將右心耳組織取出后處理，加入500 μLRIPA 裂解液裂解，再加入蛋白酶抑制劑(1 mM)，待充分混勻、裂解后，靜置15 min，置于4oC離心機中12 000 r/min離心15 min，取上清進行BCA試劑盒對蛋白定量，使用SDS-PAGE 電泳法得到凝膠圖像，進行半定量分析。嚴格按照說明書操作。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組在年齡、性別、手術方式等方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；超聲心動圖結果顯示AF病人左房內徑(58.9±7.2) mm。較對照組(37.9±8.1) mm顯著增大，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組miR-101、CACNB2和NCX通道m(xù)RNA的表達水平 試驗組miR-101表達水平較對照組低，CACNB2和NCX通道的mRNA水平均較對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

組別nmiR-101CACNB2的mRNA水平NCX的mRNA水平試驗組1000.6207±0.13211.9800±0.31511.8027±0.2811對照組1002.3100±0.34220.7526±0.38300.6021±0.2911P<0.05<0.05<0.05

2.3 免疫印跡法對CACNB2和NCX蛋白表達水平分析 CACNB2和NCX蛋白的表達水平均較對照組高，與CACNB2和NCX通道的mRNA水平具有相同的變化，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

組別nCACNB2蛋白表達NCX蛋白表達試驗組1001.36±0.181.46±0.12對照組1001.10±0.251.06±0.21P<0.05<0.05

3 討 論

AF是一種嚴重的心律失常疾病，病人失去規(guī)則有序的心房活動，導致心房顫動。近年來，伴隨人口老齡化日益加重，我國AF患病率逐年上升，嚴重影響了人們的健康生活，特別是高致死率的特點成為AF病人的巨大陰影。由于現(xiàn)在醫(yī)療條件和科技發(fā)達程度的限制，人們對于AF的發(fā)病機制尚不明確。目前針對AF的治療主要包括抗凝藥物和抗心律失常藥物的開發(fā)和使用，但是對于持續(xù)性AF的治療具有很大限制。為了臨床AF防治手段的開發(fā)，探索AF的發(fā)病機制，需找新的靶點成為醫(yī)學研究的重要內容。

研究報道[5-7]，miR-101表達量的下調可能與AF的發(fā)生有關。隨后研究者又發(fā)現(xiàn)CACNB2[3]、NCX[4，8]可能是miR-101的靶基因，但是未給出深入研究。另外，關于CACNB2的表達變化與miR-101表達之間的關系也尚未可知。

本研究針對miR-101和CACNB2、NCX的表達量與AF之間的相關性及CACNB2、NCX表達量與miR-101表達量的調控關系進行了驗證。以AF病人為主要研究對象，設為試驗組，與非AF病人進行對照研究。結果表明，兩組在年齡、性別、手術方式等方面的差異無統(tǒng)計學意義，AF病人左房內徑較對照組顯著增大。通過生物信息學手段，對兩組病人右心耳組織中的總microRNA表達量和CACNB2、NCX通道的mRNA表達量進行檢測。實時熒光定量 PCR結果表明，AF病人右心耳組織中的microRNA-101表達量較正常病人低，與文獻報道一致[9-10]。證實了右心耳組織中的microRNA-101表達量與AF有關，在AF病人中的表達量下調。同時發(fā)現(xiàn)，AF病人右心耳組織中的CACNB2、NCX通道的mRNA表達量較正常病人表達量高，說明右心耳組織中的CACNB2、NCX通道與AF的發(fā)生也具有相關性，參與AF的發(fā)生。通過免疫印跡法對CACNB2和NCX蛋白表達水平進行定量，結果發(fā)現(xiàn)，AF病人右心耳組織中的CACNB2和NCX蛋白的表達水平均較正常病人高，與CACNB2和NCX通道的mRNA表達量具有相同的變化規(guī)律，符合microRNA-101的生理調節(jié)規(guī)律，證實了CACNB2和NCX通道作為microRNA-101的調節(jié)靶點，參與了AF的發(fā)生。由于NCX是心肌細胞膜上的一種膜轉運蛋白，具有維持細胞內鈣離子平衡的作用。NCX表達量的改變證明了電子通道在AF發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用[8，11]，也說明了心肌細胞內過量的鈣離子對引發(fā)AF發(fā)生的重要作用[12]。

microRNA-101表達量與AF的發(fā)生和發(fā)展相關聯(lián)，即AF病人血清中的microRNA-101表達下調。此外，CACNB2和NCX蛋白與microRNA-101的表達相關，即microRNA-101上調CACNB2和NCX的表達，繼而誘發(fā)或加重AF。

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(本文編輯王雅潔)

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引用信息：李菲.MicroRNA-101、L型鈣通道β2及鈉鈣交換體在房顫病人血清中的表達變化及臨床意義[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(6)：712-714.

R541.7 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.027

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2016-09-03)