施氮與不施氮條件下玉米開花期相關性狀的 QTL 定位

郭向陽，陳建軍，衛曉軼，祝云芳，王安貴，劉鵬飛，湯繼華，陳澤輝*

（1 貴州省旱糧研究所，貴陽 550006；2 貴州省遵義市輝煌種業有限責任公司，遵義 563100；3 河南農業大學農學院，鄭州 450002；4 河南省新鄉市農業科學院，新鄉 453000）

施氮與不施氮條件下玉米開花期相關性狀的 QTL 定位

郭向陽1，陳建軍2，衛曉軼3,4，祝云芳1，王安貴1，劉鵬飛1，湯繼華3*，陳澤輝1*

（1 貴州省旱糧研究所，貴陽 550006；2 貴州省遵義市輝煌種業有限責任公司，遵義 563100；3 河南農業大學農學院，鄭州 450002；4 河南省新鄉市農業科學院，新鄉 453000）

【目的】探究施氮與不施氮對玉米開花期相關性狀變異的影響，并定位相關 QTLs。 【方法】以玉米的骨干自交系綜 3 為供體親本，許 178 為受體親本，通過雜交、回交和分子標記輔助選擇的方法，構建了一套以許178 為遺傳背景的綜 3 染色體單片段代換系 (SSSLs) 群體，其中包含 160 個單片段代換系。以這套 SSSLs 以及許 178 為材料，采用裂區試驗設計，在施氮 (N+) 和不施氮 (N-) 條件下，通過一年三點 (貴州貴陽、德江和云南羅平) 的表型評價，利用復合區間作圖法對玉米散粉期、吐絲期和散粉-吐絲間隔期 (ASI) 3 個開花期相關性狀進行 QTL 定位。 【結果】在基因組范圍內，2 種氮處理條件下共定位到 54 個開花期相關性狀 QTLs，主要定位在第 1、3、6、9 和 10 染色體上。其中 5 個 QTLs 在 3 個環境中均被檢測到。施氮條件下，吐絲期 (DTS) 相關位點 qDTS9a，位于第 9 染色體，可解釋表型變異的 3.05%；吐絲散粉間隔期 (ASI) 相關位點 qASI10a，位于第10 染色體，可解釋表型變異的 30.74%。不施氮條件下，散粉期 (DTP) 相關位點 qDTP9，可解釋表型變異的3.43%；吐絲期相關位點 qDTS9a，位于第 9 染色體，可解釋表型變異的 4.08%；ASI 相關位點 qASI10，位于第10 染色體，可解釋表型變異的 50.28%。對不同處理條件下的定位結果比較發現，不施氮條件下檢測到的 QTLs數目顯著高于施氮條件下的檢測數量。 【結論】不同氮素處理下存在一些共有的控制玉米開花期相關的遺傳區段，分別位于 Bin9.02 (umc1170-umc1636-bnlg1401-umc1271) 和 Bin10.04 (umc1077-umc1053-umc2350)，這些區段可能在玉米氮素吸收、轉運和利用過程中起重要作用，可作為下一步精細定位和圖位克隆玉米開花期相關基因的重要候選區域。

玉米；SSSL；不同氮處理；開花期相關性狀；數量性狀基因座 (QTLs)

氮作為玉米必需的大量營養元素之一，在其生長和發育過程中起著重要作用。長期以來，為追求玉米產量，氮肥被大量使用在玉米的栽培過程中。有報道顯示，發達國家的農業氮肥使用量超過 500萬噸，發展中國家則遠遠超過該數字。過量使用氮肥 造 成 土 壤 、 淡 水 以 及 大 氣 等 嚴 重 污 染[1]。 長 期 以來，為探索玉米產業可持續發展途徑，研究者從土壤供氮能力、施肥量、作物本身的氮素吸收和利用能力等方面對氮素利用效率進行了大量的探索，揭示了不同地區的施肥量與玉米高產潛力的關系，說明了不同土壤的供氮能力對玉米產量提高的作用，并在此基礎上培育出一系列的高產、高效優勢玉米自交系或雜交種。如 Mo17，掖 478 等在低氮條件下往往表現出嚴重的缺氮癥狀，而大多數自交系表現為中間類型。沈 125 表現出一定程度的低氮耐受性[2]。劉建安等[3]研究表明，不同雜交種對氮水平的反應存在顯著差異。劉宗華等[4]利用許 178 和黃 C 構建的F2∶3群體研究了不同氮水平條件下玉米株高變異的遺傳差異，結果表明許 178 具有較黃 C 更高的低氮耐受性，并定位到了一些與氮素利用效率相關的重要QTLs。鄭祖平等[5]利用 Mo17 和黃早四構建的 RIL 群體 定 位 到42 個 可 能 與 玉 米 對 低 氮 脅 迫 相 關 的QTLs。然而，氮素吸收利用是一個復雜的網絡調控過程，涉及到很多微效位點或基因，且不同性狀在不同氮處理條件下，其遺傳差異也不盡相同。因此，針對不同性狀，構建相應的分離群體并以不同的表型性狀作為目標，探究不同氮處理水平對目標表型變異的影響并定位出相應的遺傳位點，將會為深入解析玉米氮素利用效率的遺傳基礎提供進一步的支持。

開花期作為玉米重要農藝性狀，對玉米籽粒產量、地域與季節的適應性都具有十分重要的決定作用[6]。不同來源種質之間的開花期相關性狀存在豐富的變異，在溫帶材料與熱帶種質之間的差異尤其突出。為研究不同種質開花期變異的遺傳基礎，研究者基于不同群體，定位了大量與開花期相關遺傳位點。目前，在 MaizeGDB 上已經公布的玉米花期相關 QTLs 達 201 個(http：//www.maizegdb.org/qtl.php)，其中 156 個 QTLs 與散粉期、吐絲期和開花-吐絲間隔期 (ASI) 直接相關[7]。前人利用不同群體對玉米開花期相關性狀進行了定位研究；Veldboom 等[8]利用Mol7 × H99 的 F2∶3家系，將影響散粉期的 QTL 定位到 1、5、6、7、8 和 9 染色體上；影響吐絲期的 5個 QTLs 定位在 1、2、6、7 和 8 染色體上，影響ASI 的 QTLs 定位在第 6 和 8 染色體上。Sari-Gorla等[9]利用 B73 × H99 的 RILs 群體和 Ribaut 等[10]利用Ac7643 × Ac7729/TZSRW 的 F2∶3家系，定位到的與散粉期、吐絲期、ASI 相關的 QTLs 與前者有所差異。此外，Agrama 等[11]、Khairallah 等[12]、Austin 等[13]也對玉米花期相關性狀進行了 QTL 定位。蘭進好[6]研究表明，花期性狀 QTL 的基因作用方式以加性和部分顯性為主，上位性效應對玉米花期性狀具有十分 重 要 的 作 用 ， 韓 婭 楠 等[14]研 究 也 得 出 同 樣 結 果 。Li 等[15]利用黃早四 × 掖 107 的 F2∶3群體，在灌溉和干旱脅迫下，分別檢測到 3 個和 2 個控制 ASI 的QTLs，分別位于第 1、2、3 和第 2、5 染色體；同時，發現 ASI 與產量性狀 QTL 存在顯著關系。胡彥民等[16]利用瓊 68 和 K12 的 F2∶3群體定位到 22 個開花期相關的 QTLs，散粉期 5 個、吐絲期 4 個、散粉至吐絲間隔期 5 個、散粉周期 4 個、吐絲周期 2個、花絲活力 2 個，結果發現多數 QTL 存在環境表達的特異性。Gonzalo 等[17]利用 B73 和 Mo17 構建的RILs 群體，對不同密度下的開花期相關性狀進行定位，分別在第 2、8 染色體上檢測到開花期相關QTLs。但是利用開花期相關性狀作為目標，探究不同氮素處理對其表型變異的影響并定位相關 QTLs 的研究則少有報道。以單片段代換系為材料，采用施氮和不施氮兩種處理，鑒定不同施氮水平下的開花期相關性狀變異情況，并利用符合區間作圖法定位控制花期相關性狀的 QTLs，借助不同處理條件下的定位結果比較，鑒定出兩種條件下的共有位點。通過對兩種施氮條件下的玉米開花期相關性狀進行QTL 定位，發掘控制玉米開花期相關的遺傳區段，借助不同條件下的定位結果一致性分析，鑒定出與氮素吸收利用顯著相關的候選遺傳區段，為揭示玉米氮素效率利用差異以及分子輔助的提高玉米氮利用效率育種提供分子遺傳學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的 160 份玉米單片段代換系由河南農業大學湯繼華教授提供。該群體是以優良玉米自交系綜 3 為供體親本、許 178 為受體親本，通過雜交、回交、自交，結合 SSR 分子標記輔助選擇的方法構建而成。綜 3 和許 178 作為中國玉米育種中的骨干材料，在生產上發揮了重要作用，以這兩個材料為親本之一的重要玉米雜交種如豫玉 22 號 (綜 3 × 87 - 1) 和農大 108 (黃 C × 許 178) 等在生產上被大面積推廣應用。

1.2 試驗區概況與試驗設計

2015 年分別在貴州省德江縣 (北緯 28°15′51″，東經 108°06′39″)、貴陽市 (北緯 26°34′13″，東經106°42′39″) 和云南省羅平縣 (北緯 24°31′，東經103°57′) 進行田間試驗。試驗采用裂區設計，不同氮處理水平作為主區，設施氮 (N+) 和不施氮 (N-) 兩個水平，三個親本群體 (SSSLs) 作為副區。單行區，小區行長 4.0 m，寬行 0.7 m，每行 17 株，株距0.235 m，密度為 52500 plant/hm2，每個處理 2 次重復。對代表花期相關性狀的散粉期、吐絲期和散粉-吐絲間隔期進行鑒定和檢測。散粉期是指播種至全區 50% 以上植株雄花開始散粉的天數，吐絲期是指播種至全區 50% 以上植株雌穗花絲吐出的天數，散粉-吐絲間隔是指從散粉期到吐絲期之間的天數。試驗點各小區供試土壤耕層養分含量見表 1。

表1 0—20 cm 土層基礎肥力狀況Table 1 Soil fertility at the 0-20 cm layer

施氮處理在苗期和大喇叭口期各施尿素375 kg/hm2(N+) 。 每 個 小 區 均 基 施 過 磷 酸 鈣375 kg/hm2、硫酸鉀 187.5 kg/hm2，田間管理措施同大田。

1.3 表型數據分析與 QTL 定位

采用 SPSS17.0 統計軟件，對 160 份 SSSLs 的開花期進行單因素的方差分析和 Duncan’s 多重比較。本研究中涉及到的基因型鑒定數據的相關研究結果[18]已發表。利用完備區間作圖法對生育期相關 QTL 進行定位，若某一性狀與許 178 在 P ＜ 0.05 水平上差異顯著，則認為該單片段代換系代換片段上存在一個 QTL，并同時估算各個 QTL 的加性效應值及貢獻率[19]。

加性效應值 (A) = (單片段代換系的表型值 - 對照的表型值)/2；

貢獻率 (R) = 加性效應值/對照的表型值 × 100%。

2 結果與分析

2.1 開花期相關性狀

不同 SSSLs 開花期相關性狀的表型調查結果列于表 2。施氮條件下，散粉期不同親本群體在德江的變異范圍為 84.5～94.5 d，平均值為 88.3 ± 1.9 d；在貴 陽 和 羅 平 的 變 異 范 圍 分 別 為74.0～86.0 d 、68.0～80.5 d。吐絲期不同 SSSLs 在德江、貴陽和羅平的變異范圍分別為 90.0～99.5 d、76.5～87.0 d 和71.0～84.0 d。散粉-吐絲間隔期 (ASI) 不同 SSSLs 在德江、貴陽和羅平的變異范圍分別為 1.5～6.5 d、1.0～5.0 d 和 1.0～6.5 d。

表2 SSSLs 開花期相關性狀表型Table 2 Performance of SSSLs population in the three experimental sites

不施氮條件下，不同 SSSLs 在德江、貴陽和羅平 的 散 粉 期 的 變 化 范 圍 分 別 為 85.5～ 97.0 d、76.5～85.5 d 和 70.0～82.0 d；吐絲期的變化范圍分別為 90.0～102.0 d、80.0～88.0 d 和 73.0～85.5 d；ASI 變 化 范 圍 分 別 為2.5～6.0 d、1.5～5.5 d 和1.0～7.5 d。開花期相關性狀在不同處理條件下均表現出較為豐富的表型變異，為后續的 QTL 定位提供了較為豐富的表型數據。

2.2 控制玉米開花期相關性狀的 QTLs

對不同氮素處理條件下的開花期性狀 QTL 定位結果列于表 3。結果顯示，施氮 (N+) 和不施氮 (N-)兩 種 處 理 條 件 下 ， 共 檢 測 到 54 個 開 花 期 性 狀QTLs，分布在除第 2 和 4 染色體外的其它染色體上。其中在德江試驗點，兩種氮處理水平下共檢測到 18 個 QTLs；在貴陽試驗點，兩種氮處理水平下共檢測到 17 個 QTLs；在羅平試驗點，兩種氮處理水平下共檢測到 19 個 QTLs；其中單個 QTL 可解釋目標表型變異的變幅為 2.2%～80.0%。

在施氮條件下，3 個地點共鑒定出 6 個控制散粉期的一致性 QTLs，分布于第 1、6、7、10 染色體上，單個 QTL 可解釋的表型變異介于 2.5%～8.8%之間，其中 1 個 QTLqDTP6 在兩個地點 (德江、羅平) 被同時檢測到，位于 Bin6.04，在德江和羅平點的貢獻率分別為 8.8% 和 3.4%，且來自于許 178 的等位基因起增效作用。對于吐絲期，在 3 個環境條件下共鑒定到 7 個 QTLs，分布在第 1、3、5、6、7、9 染色體上，單個 QTL 所解釋的表型變異介于2.5%～7.7% 之間。其中 1 個 QTLqDTS9a 在三個地點被同時檢測到，位于 Bin9.0 區域，其貢獻率分別為 2.5% (德江)、3.1% (貴陽) 和 3.6% (羅平)，且來自許 178 的等位基因起增效作用。對于 ASI，在 3 個地點共鑒定到 4 個共有 QTLs，分布在第 5、9 和 10 染色體上，單個 QTL 所解釋的表型變異介于 13.6%～62.5% 之間。1 個 QTLqASI10a 在三個地點被同時檢測到，位于 Bin10.04 區域；其貢獻率分別為 13.6% (德江)、50.0% (貴陽) 和 28.6% (羅平)，來自于許 178的等位基因起增效作用。

不施氮條件下，3 個地點共鑒定到 7 個散粉期相關 QTLs，分布在第 1、5、6、8、9 和 10 染色體上，單個 QTL 所解釋的表型變異介于 2.2%～6.7%之間。1 個 QTLqDTP9 在三個地點被同時檢測到，位于 Bin9.02，可解釋的表型變異分別為 2.2% (德江)、2.5% (貴陽) 和 5.5% (羅平)，來自于許 178 的等位基因起增效作用。在 3 個地點共鑒定到 8 個吐絲期 QTL，分布在第 1、3、5、8、9、10 染色體上，單個 QTL 所解釋的表型變異介于 1.8%～7.0% 之間。1 個 QTLqDTS9a 在三個地點被同時檢測到，位Bin9.02，在 3 種環境的貢獻率分別為 3.2% (德江)、3.0% (貴陽) 和 6.0% (羅平)，來自于許 178 的等位基因起增效作用。在 3 個地點共鑒定到 4 個散粉-吐絲間隔期 QTL，分布在第 3、9 和 10 染色體上，單個QTL 所解釋的表型變異介于 12.5%～80.0% 之間，1個 QTLqASI10a 在三個地點被同時檢測到；qASI10a位于 Bin10.04，在 3 種環境的貢獻率分別為 12.5% (德江)、80.0% (貴陽) 和 58.3% (羅平)，來自于許 178的等位基因起增效作用。這些染色體區段將作為下一步精細定位和圖位克隆玉米生育期相關性狀候選基因的重點區域。

3 討論

關于玉米氮高效利用的 QTL 定位研究前人已有報道[20-24]。Gallais 等[25]在高氮水平下和低氮水平下檢測到的 QTL 有很大差別；Agrama 等[21]的研究發現在低氮和高氮水平下既有相同的 QTL 也有特異表達的QTL。本研究中，施氮條件下，在染色體 Bin1.03 區域，檢測散粉期 QTLqDTP1b 和吐絲期 QTLqDTS1，代換片段均為 phi001-phi095-bnlg182，該研究結果與前人的定位結果存在一定的一致性，只是在他們的研究中，該區域存在一個分別與株型性狀和絲黑穗病抗性相關的 QTL-qDH12[26-27]，一定程度上反映出生育期與生物量以及抗病性之間是存在一定關系的。在 Bin6.04 區域，存在一個與散粉期和吐絲期顯著相關的 QTLs (qDTP6 和 qDTS6)，代換片段均為umc1014。在 Bin7.05 區域，檢測到控制散粉期變異的 QTLs，qDTP7a 和 qDTP7b，吐絲期 QTLqDTS7，而前期報道則在該區域檢測到一個與株高相關 QTL和葉面積相關 QTL qLA-6[26]。說明了在不同氮素處理條件下，一些共有的和特異性遺傳位點共同起用，從而影響玉米氮素利用的效率。

除此之外，兩種氮處理條件下，共檢測到 31 個控制玉米開花期相關性狀的 QTLs。不施氮條件下，在 染 色 體bin8.05 區 域 ， 檢 測 到2 個 散 粉 期QTLqDTP8 和 QTLqDTS8，其代換片斷為 bnlg2046-bnlg162-umc1889-umc2401-umc2356-umc1724，在該區 域 存 在 穗 行 數 相 關 QTL qKRN8-2QTL[28]。 在Bin9.06 區 域 ， 檢 測 到1 個 吐 絲 期 相 關 QTL qDTS9b，代換片段為 umc2345-umc2207-bnlg292；在染色體 Bin10.04 區域，檢測到 1 個吐絲期 QTL qDTS10，代換片段為 umc1077-umc1053-umc2350；與Khairallah 等[29]基于 F2 群體的定位結果較為一致，他們在該區域定位了一個控制 ASI 的 QTL；另外，Ducrocq 等[30]基于不同日照長短自交系構建的近等基因系群體，通過關聯分析的方法也在該區域定位到一個與玉米散粉期相關的主效 QTLs，其貢獻率為40%。進一步說明了本研究結果的可靠性。更為重要的是，本研究在兩種氮處理條件下，共檢測出在 3個試驗環境中均穩定表達且效應較大的一致性QTLs，分別位于 Bin9.02 區域 (qDTS9a)(umc1170～umc1636～bnlg1401～umc1271) 和 Bin10.04 區域(qASI10a)(umc1077～umc1053～umc2350)。盡管這些區域在前人的研究中與穗粗、穗行數等顯著相關[27]，但是關于該群段在玉米氮素吸收、轉運以及利用過程中的重要性的研究則沒有。本研究結果證明了這些區段在玉米不同氮素處理過程中均起著重要作用，對于深入挖掘玉米氮素利用效率將提供更為可靠的分子遺傳學信息。

4 結論

玉米在不同氮素處理條件下既存在一些共有的主效 QTL，如 qDTS9a、qASI10 在施氮和不施氮條件下均被檢測到；同時還存在一些特異性的 QTL 區段，如 qDTP9 僅在不施氮條件下被檢測到。這些染色體區段將為進一步改良玉米氮素利用效率以及相關候選基因的圖位克隆等提供更多的分子遺傳學支持。

致謝:貴州省旱糧研究所楊明倫老師在田間管理過程中給予幫助；貴州省旱糧研究所吳迅博士在文章修改中提出寶貴意見與建議；在此表示感謝。

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QTL mapping of flowering related traits of maize with and without nitrogen application

GUO Xiang-yang1, CHEN Jian-jun2, WEI Xiao-yi3,4, ZHU Yun-fang1, WANG An-gui1,
LIU Peng-fei1, TANG Ji-hua3*, CHEN Ze-hui1*
( 1 Guizhou Institute of Upland Crops, Guiyang 550006, China; 2 Huihuang Seed Industry Co., LTD, Zunyi Guizhou 563100, China; 3 College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 4 Xinxiang Academy of Agricultural Sciences of Henan Province, Xinxiang Henan 453000, China )

【Objectives】The purpose of this study was to dissect variation of maize flowering-related traits under two conditions of nitrogen applied normally or none, and to map the related QTLs. 【Methods】 One panel included 160 Single Segment Substitution Lines (SSSLs) was constructed by using foundation parental lines of Zong3 and Xu178 as donor and receptor parents, respectively. The panel was treated with two conditions of nitrogen applied normally or none by using the split-plot experiment design, and the nitrogen treatment was set as the main plot and genotypes were set as the sub-plots under three environments, including Guiyang, Dejiang in Guizhou Province and Luoping in Yunnan Province. Three flowering-related traits, including day to pollen (DTP),day to silk (DTS) and anthesis-silking interval (ASI), were investigated in one treatment. 【Results】The results showed that across the whole genome, about 54 flowering-related traits QTLs were identified under the two N treatments, which were mainly located on the chromosome 1, 3, 6, 9 and 10, among them, 3 QTLs were common under three environments. Under N+treatment, QTL qDTS9a controlling day to silling (DTS) was found which was located on chromosome 9, and could explain 3.05% genetic variation; another QTL qASI10a controlling the ASI was also found, which located on chromosome 10, and could explain 30.74% genetic variation. Under N-conditions, QTL qDTP9 was identified, which could explain 3.43% genetic variation of DTP; qDTS9a related with DTS was found, which located on chromosome 9, and could explain 4.08% genetic variation; QTL qASI10 was also identified, which located on chromosome 10, and could explain 50.28% genetic variation. Comparing between N+ and N- conditions showed that, the QTLs identified under N- was much more than those under N+ treatment. 【Conclusions】Two commonly QTLs are existed in the two nitrogen treatments, one is qDTS9a, which is located on Bin9.02, with flank markers of umc1170-umc1636-bnlg1401-umc1271, and the other is qASI10a, which is located on Bin 10.04, with flank markers of umc1077-umc1053-umc2350. These loci may play important role in nitrogen absorbing, transporting, and utilization during maize development, and served as candidate loci in further map-based cloning of maize flowering-related traits.

maize; single segment substitution lines (SSSLs); nitrogen levels; flowering related traits; quantitative trait locus (QTLs)

2016-07-18 接受日期：2016-11-22

貴州省農業科學院自主創新項目（黔農科院自主創新科研專項字[2014]006號）；貴州省科技支撐計劃項目（黔科合支撐[2016]2605號）；國家“七大作物育種”專項（2016YFD0101206-4）資助。

郭向陽（1982—），男，河南滑縣人，博士研究生，副研究員，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail:xyguo0372@163.com

* 通信作者 E-mail:Tangjihua1@163.com；Tel:0851-83760096，E-mail:chenzh907@sohu.com