水產品中藥物殘留檢測能力驗證實驗的技術關鍵點

黃冬梅，劉歡，李晉成，蔡友瓊*

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.中國水產科學研究院，農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141)

水產品中藥物殘留檢測能力驗證實驗的技術關鍵點

黃冬梅1，劉歡2，李晉成2，蔡友瓊1*

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.中國水產科學研究院，農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141)

能力驗證是實驗室管理水平和檢驗技術能力的綜合表現，參加能力驗證有助于提升實驗室技術能力。文章對近幾年水產品中藥物殘留檢測能力驗證存在的主要問題進行梳理，包括實驗中缺少試劑空白及樣品空白、定量方法不合理、檢測人員對標準方法中技術要點把握不到位等，并對做好水產品中藥物殘留檢測能力驗證考核實驗需要把握的幾個關鍵點進行了探討分析，旨在促進實驗室管理技術水平的提高和實驗室整體能力的提升。[中國漁業質量與標準，2017,7(2):19-23]

水產品；藥物殘留；能力驗證；檢測方法；技術關鍵點

能力驗證是通過實驗室間比對實現對一個實驗室的能力進行考核、監督和確認的一種驗證活動，它可以補充實驗室內部的質量控制程序，增加實驗室客戶對實驗室能力的信任，有利于實驗室整體水平的提高[1-2]。參加能力驗證活動也使實驗室人員能力得以鍛煉和提高,為實驗室的持續發展和能力建設提供保障[3-6]。但在每次能力驗證考核中總有不滿意的結果，陳其勇等[7]對2003年植物油中七氯等3種有機氯農藥檢測能力驗證工作進行匯總，21家實驗室參加考核，實驗室滿意結果率為81.0%～85.7%。孫雷等[8]總結了2011年中國獸醫藥品監察所組織實施的豬肉中4種磺胺類藥物殘留檢測能力驗證工作，在參加的37家實驗室中，4種磺胺類藥物的實驗室滿意結果率分別為93.9%、93.9%、93.9%和94.1%。同時對不滿意結果進行分析，認為主要有3個方面的影響因素：標準物質、樣品前處理過程和定量方法。

近幾年來，由農業部農產品質量安全監管局和漁業漁政管理局組織實施水產品中藥物殘留檢測能力驗證工作，考核的項目為硝基呋喃類代謝物、孔雀石綠、磺胺類和氯霉素[9]。2016年水產品的考核項目為孔雀石綠和硝基呋喃類代謝物，在參加孔雀石綠考核的96家實驗室中滿意結果率為97.9%，在參加硝基呋喃類代謝物考核的87家實驗室中滿意結果率為94.3%，說明參加能力驗證的絕大多數實驗室可以準確檢測以上藥物，但是也還存在結果不滿意的實驗室。本文對近年來參加能力驗證結果不滿意實驗室中存在的問題進行匯總，主要包括能力驗證考核實驗中缺少試劑空白及樣品空白、檢測人員對標準方法中技術要點把握不到位、儀器運轉不正常、未有效開展質量控制和質控方法不合理等。并從能力驗證前的準備工作、過程中的質量控制和數據上報前的結果分析等方面探討做好水產品藥物殘留檢測能力驗證考核實驗的方法，以期為今后各實驗室的能力驗證考核工作提供參考。

1 水產品藥物殘留檢測能力驗證過程中存在的主要問題

1.1 缺少試劑空白及樣品空白

部分實驗室在開展能力驗證樣品檢測時未能同步做試劑空白和樣品空白的測定，無法確認在檢測過程中所用到的試劑是否存在干擾或污染，或是發現存在干擾，在計算結果時沒能扣除，導致定量結果偏高，超過了能力驗證判定標準。

實際能力驗證樣品在制備過程中，通常選擇的是天然大型水庫或無違禁藥物陽性檢出的水產養殖企業產品作為空白基質樣品，一般事先經過檢驗分析，確保不含目標物質，同時對空白基質的均勻性按CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》對空白基質的均勻性進行評價[8]。添加目標物后的樣品，在冷凍儲存后會進行穩定性實驗，確保能力驗證樣品的穩定性。

如果在能力驗證組織單位提供的空白樣品中發現了目標物的存在，多數是因為所用試劑中存在干擾物質，或者在檢測過程中存在交叉污染。易出現交叉污染的環節之一是在前處理過程中，如氮吹儀針頭被污染、旋轉蒸發儀在濃縮完高濃度樣品后未進行清洗、未更換移液槍槍頭造成陽性樣品和空白樣品加液時的交叉污染等；環節之二是在上機測定過程中，如未能按照樣液濃度從低到高的順序進樣、方法中沒有添加洗針程序、序列中缺少試劑空白的測定等。

1.2 定量方法不合理

通常在使用氣-質、液-質聯用儀進行藥殘檢測時，由于化合物的離子化過程不是特別穩定，有微小波動，因此需要使用內標物進行校正，消除離子化效率不穩定的影響，所以應使用內標法定量。部分實驗室在樣品提取前沒有添加內標物，無法對方法進行校正，造成檢測數據不穩定；在采用單點定量時，選取的校正點濃度與能力驗證樣品目標物待測濃度差距較大導致定量不準確，通常兩者相差應不超過2倍為宜；而在采用標準曲線定量時，濃度點設定不合理，使得能力驗證樣品的濃度點落在標準曲線的邊緣或在標準曲線的范圍之外，結果出現偏差；此外，不同的基質可能對目標物產生響應值增強或減弱效應，如未能采用空白基質標準添加法做標準曲線，方法會存在基質效應，導致回收率偏低或偏高。

1.3 未注重內標物和目標物的同步性

水產品藥物殘留檢測能力驗證采用的是在空白基質中添加目標物的方式，制備后的能力驗證樣品會放置一段時間后發放給各單位進行檢測，而內標物是每個實驗室開始檢測時添加的，這兩者存在時間差。如果加入內標物后立刻開始檢測，與事先添加較長時間的目標物比較，兩者存在不一致，建議在能力驗證樣品到達實驗室后，充分解凍，添加內標物后應避光冷藏放置一段時間，再按照規定的檢測方法開始樣品前處理步驟，盡量使內標物與目標物狀況保持一致。

1.4 未有效開展質量控制

能力驗證實驗中的質量控制可保證結果的可控性。水產品藥物殘留檢測能力驗證中的質量控制包括平行樣分析、質量控制圖、質控樣品等方式，其中質控樣品的檢測是重要環節之一，在沒有陽性標準樣品的情況下可通過加標回收率來考察，加標回收率應控制在標準范圍內[10]。個別實驗室的檢測人員未能合理正確地開展質控樣品的檢測，不能有效發揮質控樣品的作用，無法對檢測準確度起到保證作用，導致質量控制存在缺陷。

1.5 儀器運轉不正常

參加能力驗證前儀器設備發生故障，檢修后未按要求對儀器設備的靈敏度、準確度、穩定性等參數進行校準或檢測，使用該儀器進行測定，導致檢測的化合物響應值出現偏差。即使做能力驗證實驗前運行正常的儀器，在實驗中也需要時刻關注儀器狀態，最簡單的方法就是關注內標物的出峰情況，數值有無明顯波動。反之通過能力驗證活動，也可以從多個角度使用和驗證檢測設備的完好性和準確性，同時鍛煉了檢測技術人員對儀器設備使用的適應性，提高檢測運行質量[11]。

1.6 檢測人員對標準方法中關鍵點的把握不到位

實驗室檢測人員有變動，新進檢測人員上崗前，未能按照規定進行充分系統的學習和培訓，無法熟練掌握標準方法中的基本要求，不能正確地開展能力驗證考核實驗，缺乏對檢測結果進行正確判斷的經驗；檢測人員對方法的操作練習不足，對檢測關鍵點的掌握不夠,未能完全嚴格按照標準方法或作業指導書要求進行檢測[11],操作中不確定因素較多，對檢測結果的把控也存在不穩定性等。實驗室檢測人員必須通過學習和操作不斷提高自身檢測技術水平，成為具有責任心強、工作態度積極、作風科學嚴謹和檢測技能熟練的檢測人員[12]。

1.7 實驗室檢測能力有待提高

實驗室在得到能力驗證不滿意結果時，要及時總結能力驗證活動的得失，積極查找原因，找出問題根源，采取相應的糾正措施，進行有效地整改。加強在人員、監測方法、儀器設備、環境設施以及標準物質等方面的管理，以便實驗室在今后的工作中避免此類差錯。經常性開展實驗室間比對，按照預先規定的條件，由兩個或多個實驗室對相同項目進行檢測，逐步完善能力驗證方案設計。有利于實驗室檢測技術的提高，實驗室管理能力的提升。

2 水產品中藥物殘留檢測能力驗證實驗的技術關鍵點

2.1 能力驗證前的準備工作

2.1.1 標準溶液的配制

對照標準物質證書，確認標準物質的有效期、純度、結構和分子量，根據標識的純度等內容進行換算，尤其要注意有些化合物為鹽酸鹽或草酸鹽形式，必須要計算出正確的標準溶液濃度。選擇合適的標準溶液線性范圍，線性范圍設定過寬或過窄都可能影響定量結果的準確性和擬合直線的線性系數。通常選擇5～7個濃度點，建議標準曲線的最低點為檢出限濃度點的1/2左右為宜，待測樣品的濃度最好在曲線的中間左右位置，使定量更為準確。同時必須保證標準曲線相關系數在0.999以上[13]，以確保定量的準確性，具體線性范圍則根據需要檢測的樣品濃度決定。

在配制標準溶液需進行換算時特別注意，尤其是孔雀石綠的配制，市場上購買的通常是孔雀石綠草酸鹽,該分子結構中是3份的草酸，與2份的孔雀石綠結合，因此在標準品證書上孔雀石綠草酸鹽分子量是927，草酸分子量90，孔雀石綠分子量329.4，如稱取0.01 g的孔雀石綠草酸鹽標準品，實際稱取的孔雀石綠含量是0.007 1 g。孔雀石綠草酸鹽及孔雀石綠的分子結構式如圖1和圖2。

圖1 孔雀石綠草酸鹽分子結構式Fig.1 Structural formula of malachite green oxalate

圖2 孔雀石綠分子結構式Fig.2 Structural formula of malachite green

2.1.2 試劑、器皿的處理

為確保實驗過程中對所用試劑的控制，必須做試劑空白，除不加樣品外，所有的試劑都必須參與前處理過程，包括添加內標等，并且確保試劑空白中待測物的檢出值在方法檢出限以下，否則需要更換試劑，或采用其他手段確保試劑不對檢測結果造成影響。溶液的配制應使用經計量檢定合格、在檢定周期內的移液槍或移液管等設備器皿。使用前將所用的實驗器皿按照規定要求進行洗滌，必要時用甲醇潤洗，對于進樣瓶等較難清洗的器皿，建議使用甲醇等試劑超聲清洗，盡量減少外來污染因素的引入。

2.1.3 儀器條件的優化

對實驗過程中涉及的儀器設備進行核查，檢測設備的準確性是影響能力驗證結果的關鍵因素之一，必須確保在檢定或校準有效期內，并且滿足實驗要求，如達不到檢測要求需對儀器進行調整。將新配制的標準溶液與以前的標準溶液同時上機測定，比較響應值，正常情況下響應值應一致，或有所提高，若新配標準溶液靈敏度降低，需要查找原因并優化儀器和檢測條件，包括更換離子傳輸管、清洗離子源、做儀器校正和更換色譜柱等。

2.1.4 樣品前處理方法的確定

重點是把握方法的原理和關鍵點，明確每個前處理步驟的目的，保證操作的穩定性和一致性。對檢出限和定量限進行加標測定，準確度和精密度必須要滿足方法的規定要求。如未能達到，需對操作的每個步驟進行分解，查找原因，明確是方法問題還是操作問題，該如何解決，確保這一環節的準確無誤。

例如在水產品中硝基呋喃類代謝物測定實驗中有以下5個注意點：1)加入衍生試劑之前需用玻璃棒將樣品分散，以提高酸解效率，有利于衍生；2)將鹽酸溶液濃度提高至0.3 mol/L(pH≤1),磷酸氫二鉀濃度為1.0 mol/L(加入25 mL 30%的氫氧化鈉溶液，pH≥10)；3)調節pH時，只需每個品種調試1個樣品即可；4)乙酸乙酯提取時要充分振蕩，提高萃取效率；5)氮吹濃縮后若溶解液渾濁，可以加2 mL正己烷混勻后放入冰箱中冷凍0.5～1 h，高速(8 000～10 000 r/min)離心6 min，直接取下層溶液過膜測定。

水產品中孔雀石綠測定實驗中有以下4個注意點：1)提取時需及時徹底分散樣品，因為乙腈和樣品中的水互溶，樣品因脫水易結塊，影響提取效率；2)過中性氧化鋁柱時速度不能太快，可在重力作用下自然過柱；3)樣液濃縮蒸干后溶解殘渣時，應分步加入乙腈和乙酸銨溶液，且每個步驟都要超聲，提高溶解效率；4)樣液進樣品瓶前必須過0.22 μm有機相膜，實驗證明水相膜對目標物有吸附。

2.2 能力驗證實驗中的質量控制

2.2.1 同步做質控樣品

實驗室應該在參加能力驗證之前策劃能力驗證實驗的全部工作步驟，質控樣品和待檢樣品必須在相同條件下進行測定，以保證檢測結果的可控性，達到預期的準確度。

質控樣品的添加濃度通常為2～5倍定量限的添加水平，濃度水平盡量與待檢樣品的濃度保持一致，不能相差過大。質控樣品可以選擇在空白樣品的基礎上進行加標，也可把已知量值的陽性樣品當作質控樣品，包括以往實驗室參加能力驗證多余的陽性樣品、多家實驗室進行比對過的樣品或可購買的有證標準樣品[14]。同時確保質控樣品和待檢樣品檢測時每個步驟操作的一致性，降低誤差。

2.2.2 基質效應的解決方法

所謂基質，是指樣本中除分析物以外的組成，基質常常由于響應值的專屬性不強而對分析物的分析過程有顯著的干擾可能會減少響應，也可能會增加響應，不可預測，因此會影響分析結果的準確性。在水產品中藥物殘留檢測中，通常可以采用標準添加法[15]，即在篩選出的空白樣品(基質最好與能力驗證樣品一致)中添加5～7個濃度點的標準溶液，與待測樣品采用相同的方法進行前處理，上機測定后作為定量標準曲線使用，可有效解決基質效應問題。

2.2.3 規范樣品測定順序

樣品的測定順序按照先測試劑空白和樣品空白，再測低濃度樣品，最后測高濃度樣品的順序，防止高濃度樣品污染儀器，對后續樣品造成影響。在樣品測定序列中穿插標準溶液的測定，根據標準溶液的響應值，可以掌握儀器的工作狀態。每個樣品需上機平行測定兩次，可降低因儀器不穩定造成的數據誤差。

2.2.4 雙人負責制

檢測過程需采用雙人負責制的模式。即需要按照1人主檢，1人復核的模式操作。雙人負責可以避免偶然誤差的發生。檢測人員和復核人員應由有經驗，長期從事水產品藥物殘留檢測的技術人員擔任，必須熟悉檢驗方法，能把握操作中的關鍵步驟，對于檢測過程中的突發事件能正確應對處理。

2.3 數據上報前的結果分析

2.3.1 平均值法計算檢測結果

取平均值的目的是避免偶然誤差、降低操作誤差、提高可信度。在檢測過程中有時會發現3個能力驗證樣品中有2個的結果平行性較好，有1個數值偏離，無法確認哪個數值更接近真值，建議取數據的平均值，減少誤差。忌諱人為剔除平行性差的樣品結果，將自認為平行性好的樣品重復測定多次后取平均值上報，有時反將真實結果排除在外。

2.3.2 質控樣品數據的分析

根據質控樣品的回收率和精密度數據，分析此次檢驗過程的質量控制情況，必要時對比質量控制圖進行分析，明確此次能力驗證檢測結果的整體水平是偏低還是偏高，對數據的把控做到心中有數。

2.3.3 能力驗證樣品結果的判別

仔細分析樣品檢測過程、譜圖、計算及結果數據，特別是對于能力驗證樣品中添加濃度含量低的化合物，著重比較試劑空白和樣品空白的譜圖，盡量防止出現漏判、誤判的可能性。

3 總結

能力驗證結果是實驗室管理水平和檢驗技術能力的綜合表現，參加能力驗證對實驗室技術能力的提升，檢測人員技術水平的提高，及滿足社會需求都是非常必要的[16]。能力驗證結果出來后,通過對能力驗證結果的分析,可以找出自身與其他實驗室之間的差距,特別是對于不滿意能力驗證結果的認真分析和檢查,可以找到實驗室管理與技術上的漏洞,努力改進，予以提高,以達到滿意的能力驗證結果。通過這樣經常性的能力驗證活動,就可以實現對測試結果的經常性驗證,從而確保實驗室檢測結果的準確性,持續提高實驗室能力與水平。

能力驗證是一項長期持續的工作，旨在不斷提高實驗室的管理、技術水平，提升實驗室的整體能力。水產品中藥物殘留檢測能力驗證工作從2004年開展至今，取得了一定成效，大多數實驗室在能力驗證考核中取得滿意結果，但是有個別實驗室由于自身能力水平不足，加之缺乏能力驗證后續支持措施，導致多次能力驗證結果不滿意。實驗室應將能力驗證工作融入到日常檢測工作中，加強自查自糾，發現并解決自身質量管理和檢測技術中存在的問題，正確認識能力驗證的目的和作用，認真謹慎對待，并從能力驗證前的準備工作、實驗過程中的質量控制和數據上報前的結果分析等方面嚴格把關，確保能力驗證工作的有效開展，從而不斷提高自身檢測技術水平及實驗室的整體能力。

[1] 王璐，劉瀟威，彭祎，等．我國農產品質量安全檢測機構農藥殘留檢測能力驗證現狀分析[J]. 農業環境與發展， 2013(3)：90-92．

[2] 周志超，屈希彥，徐鑫．能力驗證在實驗室管理中的作用與途徑[J]. 現代測量與實驗室管理， 2010(6)：48-49．

[3] 嚴建軍，王維峰．能力驗證中存在的問題與對策[J]. 現代測量與實驗室管理， 2009(6)：44-45．

[4] 郭德華．有效開展實驗室能力驗證的對策思考[J]. 現代測量與實驗室管理， 2011(1)：40-42．

[5] 崔野韓，劉鵬程，王媛．實驗室能力驗證現狀及對策初探[J]. 農業質量標準， 2009(6)：35-38．

[6] 李錦程，陶坪，王冬妍，等．對實驗室能力驗證的認識[J]. 現代測量與實驗室管理， 2006(6)：3-37．

[7] 陳其勇，關淳，葛寶坤，等．植物油中七氯等3種有機氯農藥檢測能力驗證研究[J]. 環境與健康雜志， 2007，24(10)：811-813．

[8] 孫雷，畢言鋒，李丹，等．豬肉中磺胺類藥物殘留檢測能力驗證分析[J]. 中國獸藥雜志， 2012，46(2)：23-26．

[9] 李強，宋懌，劉歡，等．淺談水產品藥物殘留檢測能力驗證現狀及建議[J]. 福建農業， 2014(Z1)：99．

[10] 唐中奎．論實驗室管理與能力驗證活動[J]. 現代測量與實驗室管理， 2012 (6)：39-42．

[11] 席靜，張思群，劉靜宇，等． 論能力驗證活動對實驗室能力建設的作用和意義[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2011，21( 6)：1576-1577．

[12] 周崇粲，張雷． 常見能力驗證不滿意結果原因分析及對策[J]. 現代測量與實驗室管理， 2013(3)：38-39．

[13] 蔣宗莉，鄭超，吳麗慧．應對實驗室能力驗證活動探討[J]. 環境保護與循環經濟， 2013(5)：53-55．

[14] 宋國強，施敏芳，李可芳，等．用有證標準樣品進行能力驗證的方法探討[J]. 環境科學與技術， 2004，27(6)：42-44．

[15] 余孔捷，黃杰，劉正才，等．水產品中呋喃唑酮代謝物AOZ的檢測能力驗證分析[J]. 分析試驗室， 2011，31(7)：40-42．

[16] 李文龍，郭棟．加強能力驗證體系建設，促進檢測機構水平提高[J]. 現代測量與實驗室管理， 2010(1)：38-40．

DOI：10.3969/j.issn.2095-1833.2017.02.005

Introduction to the technical key points on proficiency testing of drug residuesdetermination in aquatic products

HUANG Dongmei1，LIU Huan2，LI Jincheng2，CAI Youqiong1*

(1. East Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Sciences, Shanghai 200090, China；2. Chinese Academy of Fisheries Sciences;Key Labrotary of Control of Quality and Safety for Aquatic products,Ministy of Agriculture, Beijing 100141, China)

Proficiency testing is the comprehensive index of the management level and inspection technology capability of a laboratory. Participating in proficiency testing can help to improve technical capability of laboratories. The author analyzed the problems facing the labs which failed to meet the requirements of proficiency testing in recent years. A few technical key points were discussed in this paper after in-depth analysis of the problems, such as the lack of reagent blank and sample blank in experiment, unreasonable quantitative methods, and testing personnel’s lack of grasp of the main technical points in the standard methods. The purpose was to continuously promote the management level and the overall ability of the laboratory. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(2):19-23]

aquatic products；drug residues；proficiency testing；detection method;technical key points

CAI Youqiong, caiyouqiong@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.02.004

2016-11-07；接收日期：2016-12-15

農業行業標準制定和修定農產品質量安全項目(2130109)

黃冬梅(1975-)，女，本科，研究員，研究方向為水產品質量安全檢測，hdm2001@126.com 通信作者：蔡友瓊，研究員，研究方向為水產品質量安全檢測，caiyouqiong@163.com

S91

A

2095-1833(2017)02-0019-05