CK、Ki67、Gly-3及P53在肝細胞癌組織中的表達

鄒柯涵，徐 敏，羅書笛，鄒國英，任碧瓊(.湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長沙 40008；.湖南省第二人民醫院病理科、檢驗科，湖南 長沙 40007)

CK、Ki67、Gly-3及P53在肝細胞癌組織中的表達

鄒柯涵1，徐 敏2，羅書笛2，鄒國英2，任碧瓊2
(1.湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長沙 410008；2.湖南省第二人民醫院病理科、檢驗科，湖南 長沙 410007)

目的 探討細胞角蛋白（CK）、核抗原（Ki67）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Gly-3）及抑癌基因P53在肝細胞癌（HCC）組織中的表達。方法 收集16例肝細胞肝癌患者癌組織及癌旁組織，采用免疫組化染色技術，分別檢測CK、Ki67、Gly-3及P53，分析其表達情況。結果 免疫組化檢測16例HCC癌組織中CK7、CK8/18、CK19的陽性率分別為50%（8/16）、93.8%(15/ 16)以及62.5%（10/16），Ki67的陽性率為75%（12/16），Gly-3陽性率為87.5%（14/16），P53的陽性率為50%（8/16）。結論HCC患者癌組織中CK、Ki67、Gly-3及P53的表達有不同程度的上調，其中以CK8/18陽性率最高，Gly-3及Ki67次之，P53 及CK7相對較低。

肝細胞癌；免疫組化；細胞角蛋白；Ki67；Gly-3；P53

我國原發性肝癌患者數量占全球54%，好發于男性，高發年齡為30～50歲[1-2]，每年死于肝癌的人數達37萬。肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma, HCC)是原發性肝癌中最常見的一種，占原發性肝癌的90%以上。與肝內膽管細胞癌 (HICC)和肝細胞癌-肝內膽管細胞癌混合型等其它病理類型的原發性肝癌相比，HCC的發病機制、生物學行為、組織形態、臨床表現、治療方法以及預后等方面均有其明顯的特點，因此，了解HCC組織中表達的腫瘤相關蛋白及分子的表達有利于HCC的診斷及治療。

隨著免疫組織化學染色技術的應用和不斷發展，越來越多的腫瘤相關分子的檢測可以在臨床開展[3-4]，近期推出的一系列腫瘤相關蛋白特異性免疫組織染色為肝癌等惡性疾病的診斷提供新的方向。本文初步報道肝癌患者癌組織中的細胞角蛋白7、 8/18、19、Ki67、Gly-3以及P53突變基因的表達，為各種指標的進一步應用提供實驗依據。

1 對象和方法

1.1 對象

收集湖南省第二人民醫院病理科2015年1月至2016年12月的外科手術切除的HCC患者癌組織標本16例及癌旁組織16例。病人資料見表1。

1.2 方法

組織首先用10%的甲醛固定，然后切取腫瘤組織按脫水、透明、浸蠟、包埋程序處理，4 μm連續切片，首先進行蘇木素-伊紅(HE)染色，肝癌診斷由病理專業兩位副主任醫師復診，按Edmondson-Steiner法確定肝癌分化程度。

1.3 免疫組化檢測

表1 HCC患者基本信息及病理資料

采用EnVision 2步法，切片經過烤片、脫蠟，乙醇由高至低濃度至入水，pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復上氣后加熱2 min，蒸餾水沖洗，3%過氧化氫液10 min，PBS緩沖液洗滌 3遍，每遍3 min，加羊血清37℃封閉10 min，PBS緩沖液洗3遍，每遍3 min，加一抗(鼠抗人單克隆抗體，試劑盒提供的工作液)，37℃ 2 h，PBS清洗3遍，每遍3 min，加入二抗37℃ 30 min，PBS緩沖液浸 3遍，DAB顯色，蒸餾水沖洗，復染，封片。CK19需在高溫高壓修復后，37℃進行1 min胃酶消化，PBS緩沖液洗3遍，加入一抗（試劑盒提供的工作液)。

1.4 儀器與試劑

免疫組化采用Leica BOND全自動免疫組化及原位雜交染色系統。CK、Ki67及P53試劑為儀器配套試劑；Gly-3試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.5 染色結果判斷

CK、Gly-3在細胞質中表達，Ki67、P53在細胞核中表達。陽性染黃色或棕黃色。評價標準為：細胞陽性率＜10%判定為陰性(-)；細胞陽性率10%～30%為弱陽性(+)；細胞陽性率31%～60%為陽性(++)；細胞陽性率＞60%為強陽性(+++)。

2 結果

2.1 HCC組織及癌旁組織HE染色

結果見圖1。

2.2 CK7、CK8/18、CK19的表達

16例HCC患者癌組織中CK7陽性表達8例，陽性表達率為50.0%，癌旁組織僅1例弱陽性表達,陽性率為6.25%，二者差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；16例 HCC患者癌組織中CK8/18陽性表達15例，陽性表達率為93.8%，癌旁組織僅2例陽性表達，陽性率12.5%，二者差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；16例HCC患者癌組織中CK19陽性表達10例，陽性表達率為62.5%，癌旁組織全部無表達，二者差異有顯著統計學意義（P＜0.01），染色陽性及陰性結果見圖2。

圖1 癌組織及癌旁組織光鏡圖（HE×400）

圖2 CK7、CK8/18及CK19在HCC組織中的表達（免疫組化法×100）

2.3 Ki67、Gly-3及P53的表達

16例HCC患者癌組織中Ki67陽性表達12例，陽性表達率為75%，癌旁組織2例陽性表達，陽性率12.5%，二者差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；16例HCC患者癌組織中Gly-3陽性表達14例，陽性表達率為87.5%，癌旁組織全部無表達，二者差異有顯著統計學意義 （P＜0.01）；16例HCC患者癌組織中P53陽性表達8例，陽性表達率為50%，癌旁組織全部無表達，二者差異有顯著統計學意義（P＜0.01），染色陽性及陰性結果見圖3。

圖3 Gly-3、Ki67及P53在HCC組織中的表達（免疫組化法×100）

3 討論

細胞角蛋白（cytokeratin，CK）是角質細胞中的主要骨架蛋白，它作為一種中間絲存在于所有上皮細胞及部分非上皮細胞，以維持上皮組織的完整性及連續性，根據分子量大小將其分為30種基因型。角蛋白在上皮源性腫瘤疾病的發生發展過程中出現異常表達，因此可作為腫瘤的輔助診斷指標[5]，本研究發現不同的CK在HCC中有不同的表達率，CK8/18作為應激蛋白幾乎在所有HCC組織中表達，癌旁組織也有不同程度的表達。不少研究表明CK7可以作為結直腸癌、原發性卵巢腫瘤以及肝癌等腫瘤細胞轉移的標志物[6-7]，但本研究的結果顯示CK7表達相對較低。CK19表達與細胞分化程度呈負相關[8]，表達CK19的肝癌侵襲性及惡性程度更嚴重[9]，本研究中有60%以上的HCC表達CK19，但未做進一步臨床分析。

細胞增殖核抗原Ki67定位于細胞核，在細胞增殖周期中表達，G0期缺如，G1期時即可檢測出，可提示機體細胞增殖情況。Ki67的表達上調促進腫瘤細胞增殖，對其深入研究對于了解腫瘤的生物學行為和預后有重要價值[10-13]。Ki67標記的是處于增殖周期中的細胞。該標記陽性率越高，腫瘤生長越快，組織分化越差，對化療也越敏感。一般來說，預后較差。本研究中Ki67在HCC患者癌組織中的表達陽性率為75%。

Gly-3是通過糖基磷脂酰肌醇錨連接到細胞表面的肝磷脂蛋白聚糖的磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員[14]，Gly-3在細胞增殖和在特定組織中的細胞凋亡誘導作用中具有負面作用[15]。然而，它在HCC中過表達最近也有報道[16-17]，與本研究結果相符。

P53是位于染色體17的短臂上的腫瘤抑制基因，通常調節細胞周期機制的活性。已觀察到p53基因的突變在多種類型的人類癌癥中具有高流行性，并且經常伴隨點突變發生。研究報道HCC中p53突變的頻率在18%至67%之間[18]，p53突變蛋白陰性患者為肝癌發生的早期，在肝癌發生的中期檢測到突變型p53蛋白，這表明p53突變是啟動細胞惡性轉化的關鍵因素[19]。本研究中的p53表達陽性率為50%，準備擴大樣本與結合臨床資料進行分析。

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（本文編輯 馬 薇）

Expression of CK,Ki67,Gly-3 and P53 in Hepatocellular Carcinoma Tissues

ZOU Kehan1，XU Min2,LUO Shudi2,ZOU Guoying2,REN Biqiong2
(1.Department of Pathology,Maternal and Child Health Hospital of Hunan Province,Changsha,Hunan 410008,China;2.Department of Pathology and Clinical Laboratory,the Second People's Hospital of Hunan Province,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To investigate the expression of cytokeratin (CK),nuclear antigen (Ki67),Gly-3 and P53 in hepatocellular carcinoma (HCC).Methods CK,Ki67,Gly-3 and P53 were detected by immunohistochemical staining technique in 16 patients with hepatocellular carcinoma (HCC)respectively.Results The positive rates of cytokeratin 7,cytokeratin 8/18 andcytokeratin 19 in HCC tissues were 50%(8/16),93.8%(15/16)and 62.5%(10/16),respectively.The positive rate of Ki67,Gly-3 and P53 were 75% (12/16),87.5% (12/16),and 50% (8/16),respectively.Conclusion The expression of CK, Ki67,Gly-3 and P53 were up-regulated in HCC patients,with the highest positive rate of CK8/18,followed by Gly-3 and Ki67.The expression of P53 and CK7 were relatively low in HCC patients.

hepatocellular carcinoma;immunohistochemistry;CK;Ki67;Gly-3;P53

R735.7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.03.025

2016-12-09

鄒柯涵，女，病理醫師，E-mail：727266645@qq.com。

本文引用：鄒柯涵，徐 敏，羅書笛，鄒國英，任碧瓊.CK、Ki67、Gly-3及P53在肝細胞癌組織中的表達[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（3）：326-328.