血清Hcy、Cys C聯合尿足細胞檢測對2型糖尿病腎病的早期診斷價值

劉倩，王彥，胡三強，楊伏猛

(1連云港市第二人民醫院，江蘇連云港222006；2連云港市第三人民醫院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)患者最主要的慢性微血管并發癥，是導致終末期腎病的主要原因，因此早期診斷DN顯得尤為重要[1]。目前，DN的發病機制尚未完全闡明，其早期的診斷也缺乏統一的指標。研究表明，DN的發生與氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應等有一定關聯[2]。同型半胱氨酸(Hcy)、胱抑素C(Cys C)與機體氧化應激和炎癥反應有關，而足細胞是構成腎小球濾過屏障的主要細胞。因此，本研究旨在檢測DN患者血清Hcy、 Cys C和尿足細胞等指標，評估其對DN的早期診斷價值。現報告如下。

anomalies over the western Pacific Ocean warm pool and its possible mechanism

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2016年3月于連云港市第二人民醫院內分泌科就診的2型糖尿病(T2DM)患者130例，依據1999年WHO的糖尿病診斷和分型標準確診。其中男64例、女66例，年齡(56.1±7.5)歲；排除原發性腎小球疾病、腎小管間質性疾病、急慢性心血管疾病、尿路感染及近期腎毒性藥物使用等。根據DN診斷標準[3]，參照尿白蛋白/尿肌酐比值(UACR)分為3組，即正常白蛋白尿組(NA組，UACR<30 mg/g)42例、 微量白蛋白尿組(MA組，UACR 30～<300 mg/g)45例和大量白蛋白尿組(LA組，UACR≥300 mg/g)43例。同時選取體檢中心體檢健康者40例作為對照組，其中男19例、女21例，年齡(55.8±6.9)歲。本研究經連云港市第二人民醫院倫理學委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 血清Hcy、 Cys C水平檢測 采集空腹靜脈血5 mL，常溫3 000 r/min離心10 min，分離出血清。采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀檢測血清Hcy、 Cys C水平，Hcy檢測試劑盒購自北京九強公司，Cys C檢測試劑盒購自上海藍怡公司，均按試劑盒說明書操作。

1.3 尿足細胞檢測方法[4]留取新鮮晨尿10 mL，離心5 min，棄去上清液，尿沉渣用PBS洗3次；沉渣中加入1 mL PBS重懸并平均分配至2個試管，第1管加入PE標記鼠抗人足盂蛋白(PCX)單克隆熒光抗體(美國R&D公司)50 μL作為試驗管，第2管加入PBS 50 μL作為對照管，均在4 ℃孵育45 min；離心5 min，用PBS洗3次；沉渣中加入2 mL PBS重懸，并全部轉移至BD絕對計數管；置于振蕩器上進行充分混勻后，選擇中速上BD FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測。以試驗管計數減去對照管計數絕對細胞數。絕對細胞數=(熒光標記細胞計數×已知熒光小球總數×稀釋倍數)/(熒光小球計數×樣本總體積)。

2.3 血清Hcy、Cys C和尿足細胞對DN的早期診斷價值 將對照組和NA組患者作為研究對象，以腎小球濾過率(GFR)<90 mL/min作為DN診斷切點。運用ROC分析顯示，血清Hcy、Cys C水平和尿足細胞數量診斷DN的最佳切點分別為8.75 μmol/L、0.76 mg/L和0.73 個/μL，其對應的曲線下面積分別為0.74、0.79和0.76。三個指標聯合診斷DN的最佳切點為81%，曲線下面積為0.92。3個指標診斷敏感性Cys C>足細胞>Hcy，且三者聯合檢測可以顯著提高診斷敏感性(P均<0.05)。見表2。

2.1 各組血清Hcy、Cys C水平及尿足細胞數量比較 NA、MA、LA組血清Hcy、Cys C水平及尿足細胞數量均高于對照組(P均<0.05)；并且，隨著DN的進展，血清Hcy、Cys C水平及尿足細胞數量逐漸增加(P均<0.05)。見表1。

2 結果

DN是最常見的DM慢性微血管并發癥，其病理特征表現為腎小球硬化，一旦出現臨床蛋白尿，腎功能將出現不可逆的損傷，是DM患者致死的主要原因之一[5]。Hcy屬于含硫氨基酸，是甲硫氨酸循環的代謝產物，是一類具有微血管損傷作用的氨基酸。其能對血管內皮細胞造成損傷，促進脂蛋白氧化、平滑肌細胞增生和血小板聚集，影響腎血管內皮細胞和腎小球基底膜功能。DM患者體內糖脂代謝異常會導致Hcy生成過多，進而誘導氧自由基生成，導致微血管氧化應激損傷[6,7]。Wang等[8]研究顯示，DN患者血清Hcy水平顯著高于正常人群，并伴隨著疾病的加重而升高，并認為Hcy是一個可用于預測早期DN的獨立危險因素。Mao等[6]研究也表明，Hcy能夠預測DN的發生和進展。DN患者體內Hcy升高的原因可能包括：①由于腎功能受損，其催化Hcy轉變為半胱氨酸和α-丁酮酸的代謝途徑減弱，從而表現為腎臟清除Hcy能力不足；②DN患者體內含硫氨基酸的代謝和Hcy再次甲基化能力不足，導致體內Hcy產生過多[9]。本研究發現，伴隨DM患者尿蛋白的增加血清Hcy水平不斷增高，表明血清Hcy對DN的早期診斷和病情判斷具有一定的價值。

使用AMOS進行結構方程建模及分析，以找出船員疲勞與疲勞影響因子之間的聯系，船員的負荷矩陣見表5，基本研究方法見圖2。

表1 各組血清Hcy、Cys C和尿足細胞檢測結果比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與NA組比較，bP<0.05；與MA組比較，cP<0.05。

表2 血清Hcy、Cys C、尿足細胞檢測對DN診斷價值(%)

3 討論

2.2 血清Hcy、Cys C和尿足細胞與UACR的關系 血清Hcy、Cys C水平、尿足細胞數量均與UACR呈正相關(r分別為0.83、0.83、0.84，P均<0.05)。

那些所謂的，不甘心、憤怒、悲傷，在我一天天的閱讀時光里消失殆盡。當我合上書本，痊愈之后，我開始了，我最璀璨的生活……□

Cys C是一種由所有有核細胞產生的低分子量蛋白，具有半胱氨酸蛋白酶抑制劑效應，能夠自由通過腎小球濾過并被腎小管上皮細胞所重吸收。其生成速度恒定，不受腎臟因素、炎癥、感染、肝臟疾病、飲食等因素影響，是反映腎小球濾過率變化的內源性標志物，同時可反映腎小球和腎小管損傷[10]。Javanmardi等[11]研究發現，血清Cys C是監測早期DN理想的生物標志物，但不能用于判斷疾病治療后的轉歸。Jeon等[12]研究顯示，血清Cys C水平的升高同時反映腎小球濾過率的下降和UACR的升高，可作為預測DN早期診斷的指標。Jeon等[13]也發現，在DM正常蛋白尿階段，Cys C水平即出現了升高，因此可作為一個潛力的標志物用于判斷腎功能的異常。本研究發現，在DM正常蛋白尿階段，血清Cys C水平即出現升高，且伴隨著尿蛋白的增加而升高。

歐洲法院也指出，雖然通常具有管轄權的法院不得對另一成員法院適用的實體法進行比較分析，但可以對其他成員國適用的取證規則、訴訟語言、判決送達期限等程序性規則進行評估⑤Case C 428/15，27 October 2016，para.57.。

在DN早期階段，腎臟病理學表現為腎小球基底膜增厚和系膜基質擴張，足細胞參與構成腎小球濾過屏障，對大分子物質滲透性起決定性作用。足細胞表面主要標志蛋白(PCX)是一種攜帶高負電荷的糖蛋白，作用是防止足突塌陷。如腎小球發生病變，脫落的足細胞可伴隨尿液排出，因此可對尿中標記的足細胞進行測定[4]。Dalla等[14]研究顯示，當DM患者出現微量白蛋白尿時，腎臟足細胞密度出現減少；當病程進展至大量蛋白尿時，則密度降低更為明顯。Tagawa等[15]在DM動物模型中發現，足細胞自噬對于保持溶酶體自穩性發揮重要作用；當足細胞脫落出現功能受損時，尿中可以檢測到大量蛋白質。本研究結果顯示，在DM正常蛋白尿階段，已經出現足細胞的脫落；且隨著疾病進展，脫落足細胞的數量顯著增加。由此可以推測，尿中足細胞測定對DN的早期預測具有一定的臨床診斷價值。

通過相關性分析還發現，血清Hcy、Cys C水平和尿足細胞數量與UACR呈正相關。進一步研究還發現，3個指標對于DN早期診斷，其診斷敏感性分別為Cys C>足細胞>Hcy，提示聯合檢測可以顯著提高診斷DN的效能。