紫外線脅迫麥長管蚜DNA差異片段的克隆及序列功能分析

趙永田+趙惠燕

摘要：應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）技術(shù)對紫外線誘導(dǎo)的麥長管蚜基因組變異進(jìn)行篩選，對獲得的63個(gè)差異片段進(jìn)行回收克隆測序。經(jīng)Blast分析，發(fā)現(xiàn)19條同源性高的基因，按照基因功能可將差異序列劃分為5類：防御基因、調(diào)節(jié)能量和信號基因、蛋白質(zhì)合成基因、損害基因、未知功能基因。蚜蟲對紫外線的響應(yīng)機(jī)制涉及多種代謝過程的基因，如與能量代謝和信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等有關(guān)的基因，還涉及具有保守結(jié)構(gòu)域的調(diào)控因子等。

關(guān)鍵詞：紫外線；麥長管蚜；DNA片段；克隆；序列分析

中圖分類號： S435.122+.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0102-03

蚜蟲是小麥上的主要害蟲，其中麥長管蚜[Sitobion avenae （Fabricius）]作為麥蚜的優(yōu)勢種群，可通過傳播病毒、刺吸汁液、分泌蜜露等方式為害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。蚜蟲作為r對策者，環(huán)境是導(dǎo)致種群分化的主要因素[1-2]。近年來，臭氧層空洞導(dǎo)致紫外線輻射劑量增加，特別是UV-B波段[3]，不可避免地對蚜蟲的遺傳與進(jìn)化產(chǎn)生巨大的選擇壓力。姚建秀等運(yùn)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術(shù)對麥長管蚜輻射誘導(dǎo)一代的DNA多態(tài)性進(jìn)行分析表明，輻射條件下的遺傳距離增大，紫外線可誘導(dǎo)產(chǎn)生種下分化[4]。都二霞等通過設(shè)置不同時(shí)間和強(qiáng)度的紫外線照射桃蚜，運(yùn)用SSR（simple sequence repeats）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代桃蚜產(chǎn)生可遺傳變異致使F2代的DNA也發(fā)生變異，且各處理平均多態(tài)位點(diǎn)率之間差異顯著[5]。趙惠燕等對桃蚜設(shè)置不同時(shí)間的紫外線誘導(dǎo)，采用SSH（spring struts hibernate）技術(shù)提取了產(chǎn)生的特異基因，進(jìn)行克隆、測序，分析了差異基因的功能，得出6類相關(guān)基因參與紫外線脅迫[6]。AFLP結(jié)合了限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）的可靠性與PCR的便捷，具有重復(fù)性好、結(jié)果可靠等特點(diǎn)。AFLP是較為理想的檢測基因組差異的手段，原因在于它不需要提前知曉基因組序列，可直接用于檢測。張根發(fā)等對低能離子誘導(dǎo)擬南芥引起的基因組DNA變異采用AFLP進(jìn)行檢測，并對差異片段進(jìn)行克隆，測序發(fā)現(xiàn)突變可能存在突變熱點(diǎn)[7]。陳照立等應(yīng)用AFLP成功回收了與二羥環(huán)氧苯并芘（BPDE）相互作用產(chǎn)生的DNA差異片段，經(jīng)克隆測序及同源性比對發(fā)現(xiàn)，9條可能導(dǎo)致BPDE引發(fā)肺癌有關(guān)的基因片段[8]。然而利用AFLP對紫外線誘導(dǎo)麥長管蚜的遺傳變異分析尚未見報(bào)道。本研究選擇麥長管蚜為試驗(yàn)材料，利用AFLP技術(shù)分析經(jīng)紫外線處理和對照組之間的DNA變異，對差異基因進(jìn)行篩選、克隆、測序，分析差異基因的功能，初步探索蚜蟲對紫外線的響應(yīng)機(jī)制，為蚜蟲進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試蟲

試驗(yàn)蟲源由德國聯(lián)邦農(nóng)林生物研究中心提供。處理方法：取發(fā)育一致的成蟲，分成對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組經(jīng)紫外線照射時(shí)間為1、2、3、4、6、8 h；對照組采用正常光照。光源高度統(tǒng)一為蚜蟲上方30 cm處。處理后的當(dāng)代成蚜標(biāo)記為F0代，繼續(xù)培養(yǎng)2代，均按照同樣處理照射成蟲，并依繁殖次序收集成蟲標(biāo)記為F1、F2代。

1.2方法

1.2.1DNA池的構(gòu)建及AFLP反應(yīng)體系

分別對不同處理時(shí)間的蚜蟲構(gòu)建DNA池。DNA的提取方法及AFLP反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.2差異表達(dá)片斷的回收、克隆與測序

用刀片切取差異條帶，用ddH2O浸泡后，取上清液重新擴(kuò)增，從瓊脂糖凝膠上回收二次擴(kuò)增差異片段。將回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取陽性（白斑）克隆進(jìn)行菌落PCR。經(jīng)鑒定的陽性克隆送上海生工生物工程公司測序。

1.2.3同源性比對

測序結(jié)果輸入美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI（http：//www.ncbi..nlm.nih.gov）網(wǎng)站，并應(yīng)用Blast工具對差異片段序列同源性進(jìn)行比對。

2結(jié)果與分析

2.1差異片斷的AFLP分析

擴(kuò)增的差異性主要體現(xiàn)為條帶的增加或缺失。通過統(tǒng)計(jì)差異條帶數(shù)目，計(jì)算不同處理的變異頻率發(fā)現(xiàn)，變異頻率隨著處理時(shí)間的增加而增大，且二者之間存在著正相關(guān)，此結(jié)論與文獻(xiàn)[10]研究結(jié)果一致。

2.2差異片段的克隆與菌落PCR鑒定

可知，質(zhì)粒的擴(kuò)增片段大小與回收的差異片段一致，表明差異片段成功連接在質(zhì)粒載體上。

2.3同源性功能分析

對63個(gè)克隆成功的序列經(jīng)測序并通過Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)有19個(gè)同源性高的基因序列，在比對的過程中發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)序列經(jīng)同源性檢測都為Fgd6 protein鳥嘌呤核苷酸交換因子，2個(gè)序列為HSP15熱休克蛋白。主要可能參與脅迫響應(yīng)的基因功能如表1所示，未列出未知功能基因。進(jìn)一步分析相關(guān)基因的功能，可以將19個(gè)序列分成5大類：防御基因，約占21%；調(diào)節(jié)能量與信號基因，約占37%；蛋白質(zhì)合成基因，約占5%；損害基因，約占11%；未知功能基因，約占26%（圖3）。

3結(jié)論與討論

通過AFLP技術(shù)，共有63個(gè)差異片段克隆并測序成功，結(jié)果表明，經(jīng)紫外線誘導(dǎo)的蚜蟲DNA變異可以采用AFLP技術(shù)進(jìn)行差異檢測與篩選。本研究與趙惠燕等的研究結(jié)論[6]一致，經(jīng)紫外線脅迫后調(diào)節(jié)能量與信號基因和防御基因表達(dá)明顯增多，表明蚜蟲面對脅迫能積極作出應(yīng)激反應(yīng)。如Hsp15，作為小分子應(yīng)激蛋白熱休克蛋白，可以與質(zhì)膜結(jié)合[11]，而質(zhì)膜是細(xì)胞吸收外界物質(zhì)的動態(tài)屏障，也是信息傳遞的通道，起到保護(hù)作用。同時(shí)小分子熱激蛋白因?yàn)榫哂蟹肿影閭H的作用，所以在不良條件下可以降低蛋白的合成折疊出現(xiàn)異常的概率和穩(wěn)定性，在不良條件下提高生存率[12]。部分熱激蛋白在序列上與細(xì)胞防脫水蛋白存在某種相似性，這種相似性可以抑制細(xì)胞脫水，使溶質(zhì)不易發(fā)生滲透，從而減輕冷脅迫對細(xì)胞膜的損害，使組織的抗冷性增強(qiáng)[13]。質(zhì)膜蛋白家族成員眾多，底物多樣，功能也較多，包括對抗生素產(chǎn)生抗性、轉(zhuǎn)換信號、表達(dá)抗原等[14-15]，但它們有共同的特點(diǎn)，能結(jié)合并水解ATP，通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)各種物質(zhì)[16]。核糖體蛋白L11在蛋白質(zhì)合成過程中必不可少，并且是高度保守的蛋白質(zhì)[17]。L11的N-末端具有分子開關(guān)功能，在EF-G依賴的遷移過程和RF1識別終止密碼子UAG的過程中都是必須的。Harms等研究表明，L11在核糖體的翻譯過程中起到分子開關(guān)的作用[18]。在脅迫的過程中發(fā)現(xiàn)，有損害功能的基因參與其中，如硫酸糖基化蛋白（94sin1），對細(xì)胞的存活及增殖分化有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[19]，但具體作用機(jī)制還不清楚。除了已知的功能基因外，本研究還得到許多同源性較高，但功能未知的基因，有待進(jìn)一步研究其在紫外線耐受方面的功能。

研究表明，蚜蟲對紫外線的脅迫響應(yīng)機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多途徑多種基因協(xié)同作用。雖然本研究獲得的差異基因反映的信息不夠全面，但通過篩選鑒別這些特異基因，分析其功能，是闡明蚜蟲對紫外線脅迫分子變異和響應(yīng)機(jī)制的必要前提，同時(shí)為蚜蟲的分子進(jìn)化提供理論依據(jù)。

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