海洋放線菌A3202在不同培養基中的培養特征比較

鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，黃振東，張利平，陳國慶

(浙江省農業科學院 浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

海洋放線菌A3202在不同培養基中的培養特征比較

鹿連明，杜丹超，胡秀榮，蒲占湑，黃振東，張利平，陳國慶*

(浙江省農業科學院 浙江省柑橘研究所，浙江 臺州 318020)

為明確海洋放線菌A3202發酵培養所需的最佳條件，促進對其活性代謝產物抑菌活性研究的深入開展，測定了菌株A3202在不同固體和液體培養基中的形態特征。結果表明：菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養基上的培養特征存在明顯差異，瓊脂含量2.0%以下的培養基不利于菌株A3202的氣生菌絲生長及孢子形成；該菌株在相同配方但不同黃豆粉來源的黃豆粉培養基上的形態特征也表現出明顯差異，現磨生黃豆粉制備的培養基更利于菌株菌絲生長和產孢。

海洋放線菌； 培養基； 培養特征； 黃豆粉

海洋微生物由于長期在高鹽、高壓、低溫、無光照的海洋環境中生長繁殖，通常具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，形成了與陸生微生物不同的生理性狀和特征，使其具備了產生結構新穎、功能特殊的活性物質的能力[1]。目前，普遍認為海洋微生物及其活性物質是新型醫藥研發的重要資源[2]。而在利用海洋微生物防治植物病害方面，目前雖然相關的研究報道較少，但卻顯示出了良好的開發利用潛力。

近年來，本課題組從海洋生物中分離了多種對植物病原菌具抑菌活性的放線菌。其中，菌株A3202對柑橘青霉病菌(Penicilliumitalicum)、柑橘綠霉病菌(P.digitatum)和柑橘炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等多種植物病原菌具有較強的抑菌活性，表現出較好的開發利用前景。為此，本研究測定了該菌株在不同固體和液體培養基中的形態特征，以期明確發酵培養所需的最佳條件，為今后對其開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

海洋放線菌A3202為本課題組從海洋生物鱗笠藤壺(Tetraclitasquamosa)中分離獲得，其對柑橘青霉病菌、綠霉病菌和炭疽病菌等多種植物病原菌均具較強的抑菌活性，初步鑒定該菌株為米修鏈霉菌(Streptomycesmisionensis)[3]，接種于高氏1號斜面培養基培養后，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 供試培養基

高氏合成1號液體培養基購自杭州百思生物技術有限公司，配方為：可溶性淀粉2.0%、硝酸鉀0.1%、磷酸氫二鉀0.05%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.05%、硫酸亞鐵0.001%，向其中添加不同量的瓊脂至終濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%。加入蒸餾水煮沸溶解，分裝至三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

液體發酵用培養基為黃豆粉培養基，配制方法為：稱取20 g黃豆粉，加入到1 000 mL蒸餾水中煮沸30 min，4層紗布過濾后取濾液，加入葡萄糖20 g、硫酸銨5 g、氯化鈉8 g和碳酸鈣2 g，加熱溶解后，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝至三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。所用黃豆粉分別為購自天津利發隆化工科技有限公司的發酵用黃豆粉，購自淘寶網上農家磨制的黃豆粉，以及利用多功能粉碎機研磨生大豆所得的黃豆粉。

1.3 菌株活化

取4 ℃冰箱保存的菌株A3202，在超凈工作臺中用無菌接種環刮取培養基表面菌絲，于新鮮制備的高氏1號培養基中劃線，然后置于28 ℃恒溫培養箱中培養至菌絲長出，作為下一步試驗用菌種。

1.4 菌株接種

用無菌接種環刮取上述培養活化的菌株A3202的菌絲，在含1.0%～3.5%瓊脂的高氏1號培養基平板上劃線，然后置于28 ℃恒溫培養箱中培養。用無菌打孔器在上述高氏1號培養基上打取直徑5 mm的菌餅，將其接種至黃豆粉液體培養基中，置于28 ℃恒溫搖床， 180 r·min-1振蕩培養。

1.5 培養特征觀察

在不同培養時間，肉眼直接觀察并記錄不同瓊脂含量高氏1號培養基上菌株A3202的培養特征。用移液槍吸取20 μL各黃豆粉培養基中菌株A3202的培養液，滴加到載玻片上，置于光學顯微鏡下觀察培養產物的形態特征并拍照。比較不同瓊脂含量高氏1號培養基及各黃豆粉液體培養基中菌株的培養特征。

2 結果與分析

2.1 菌株A3202在高氏1號培養基上的培養特征

在28 ℃恒溫培養箱中培養第3、6、10和24天，觀察并記錄菌株A3202的培養特征，結果見表1，菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養基上的培養特征如圖1所示。菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養基上的培養特征存在明顯差異，瓊脂含量2.0%以下的培養基不利于菌株A3202氣生菌絲生長及孢子的形成，而在瓊脂含量2.0%及以上的培養基上，菌株A3202生長速度較快，氣生菌絲致密發達，且易于產生大量孢子。

表1 菌株A3202在不同瓊脂含量高氏1號培養基上的形態特征

A～E為瓊脂含量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%

2.2 菌株A3202在不同黃豆粉培養基上的培養特征

28 ℃恒溫搖床180 r·min-1振蕩培養第3、7、14 d，在光學顯微鏡下觀察各培養產物的形態特征，結果見表2，菌株A3202在各黃豆粉培養基中的形態特征如圖2所示。可以看出，菌株A3202在相同配方但不同黃豆粉來源的培養基中形態特征表現出明顯差異。在生黃豆現磨成粉的培養基培養一定時間后，菌株A3202可產生大量的菌絲和孢子，而在購買的黃豆粉成品制備的培養基培養14 d后，菌株A3202只產生大量孢子，難以觀察到菌絲。

表2 菌株A3202在不同黃豆粉培養基上的形態特征

注：培養基A的黃豆粉為天津利發隆化工科技有限公司的發酵用黃豆粉，培養基B的黃豆粉為淘寶網上農家磨制的黃豆粉，培養基C的黃豆粉為生大豆現行研磨的黃豆粉。

A，菌株A3202的橢圓形孢子；B，菌株A3202的孢子變為長條形；C，菌株A3202的菌絲圖2 菌株A3202在黃豆粉培養基中培養后的不同形態特征

3 小結與討論

菌株A3202為本課題組從海洋生物鱗笠藤壺中分離獲得的放線菌，其對柑橘青霉病菌、綠霉病菌和炭疽病菌等多種植物病原菌均具較強的抑菌活性。為進一步探索該菌株對植物病害的生防潛能，我們對其發酵工藝進行了優化。在試驗過程中發現，菌株A3202在不同批次高氏1號培養基中培養特征存在明顯差異，有時難以培養獲得氣生菌絲發達的菌落，影響了菌株的保藏及擴大培養。為分析產生該問題的原因及查找解決辦法，以保障今后對菌株A3202開發利用的順利進行，特開展了本研究。結果發現，高氏1號培養基中瓊脂含量的高低與菌株A3202氣生菌絲的生長情況具有明顯相關性，相對高瓊脂濃度的高氏1號培養基利于菌株A3202氣生菌絲的生長及產孢，分析認為菌株A3202在相對干燥的環境中更易于生長產孢。菌株A3202在不同黃豆粉制備的黃豆粉培養基中形態特征表現出明顯差異，在現磨生黃豆粉制備的培養基中生長良好，可產生大量菌絲和孢子，而在其他2種黃豆粉成品制成的培養基中只產生孢子，無菌絲形成。推測可能是現磨的生黃豆粉較黃豆粉成品能提供更多的營養，從而利于菌株A3202孢子的萌發、菌絲的生長及產孢。

在利用海洋微生物防治植物病害方面，人們已開展了諸多有益的探索。如聶亞鋒等[4]從海水中分離的海洋細菌PY- sw- 1對白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)等多種病原菌表現出較強的抑制活性；何紅等[5]從海洋紅樹內分離的海洋細菌CⅢ- 1除對辣椒青枯病有良好的防效外，還能明顯促進辣椒的生長；邵彥坡等[6]從淺海海域中分離的放線菌菌株B5的發酵液對西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)等13種植物病原真菌的菌絲生長抑制率均在80%以上，且具有較好的傳代穩定性、熱穩定性和酸穩定性。本課題組已有研究表明，放線菌A3202在植物病害防治方面具有良好的開發應用前景，為此，在優化該菌株發酵工藝的基礎上，將進一步探索其對植物病害的生防潛能，為今后開發相關生防菌制劑提供依據。

[1] 尚卓, 王斌貴. 海洋真菌來源的抗菌活性物質研究:方法與進展[J]. 生命科學, 2012, 24(9): 997- 1011.

[2] 劉全永, 胡江春, 薛德林, 等. 海洋微生物生物活性物質研究[J]. 應用生態學報, 2002, 13(7): 901- 905.

[3] 鹿連明, 杜丹超, 程保平, 等. 海洋放線菌A3202的分離鑒定及其對柑橘采后病害的防效[J]. 植物保護學報, 2014,41(3):327- 334.

[4] 聶亞鋒, 劉永鋒, 李德全, 等. 海洋細菌PY- sw- 1產生的抗菌物質及其抑菌活性[J]. 植物保護學報, 2008, 35(4): 373- 374.

[5] 何紅, 歐雄常, 王立才, 等. 紅樹內生海洋細菌CⅢ- 1菌株對辣椒青枯病的防病效果[J]. 植物保護學報, 2008, 35(6): 497- 500.

[6] 邵彥坡, 方麗萍, 魏少鵬,等. 海洋放線菌B5菌株發酵液抗菌譜及穩定性研究[J]. 西北農業學報, 2007, 16(3):248- 251, 256.

(責任編輯：侯春曉)

2016- 09- 26

臺州市科技計劃項目(131ky20)

鹿連明(1979—)，男，山東安丘人，博士，副研究員，研究方向為柑橘病蟲害，E- mail: minglu79@126.com。

陳國慶(1964—)，男，浙江諸暨人，本科，研究員，研究方向為柑橘病蟲害，E- mail: cgq5373@163.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170326

Q936

A

0528- 9017(2017)03- 0446- 03

文獻著錄格式：鹿連明，杜丹超，胡秀榮，等. 海洋放線菌A3202在不同培養基中的培養特征比較[J].浙江農業科學，2017，58(3)：446- 449.